利用荧光标记通用引物的多重pcr基因分型方法
在基于微卫星的种群分析中，直接标记引物的方法过于昂贵，购买荧光物质的花费成为实际应用中最主要限制条件。本文提出新的多重PCR引物系统来节约成本，这一系统包含一条特殊的上游引物（5’端连有通用引物序列）、一条普通的下游引物和一段通用荧光引物。在试验中，我们通过拓展这一三引物系统，运用分别带有四种不同颜色荧光的四条不同通用引物，达到了在同一批次中对8个、12个甚至更多位点进行基因分型的目的。这一实用的方法在截形叶螨的徐州种群(XZ)中进行了检验。与传统的引物系统相比，新方法结果信号强度普遍减弱，但仍完全可以作为判定片段长度的依据。当进行不同物种的多个位点的检测时，整个试验费用大幅度减少。因此，这一方法可以让实验室种群分析或位点分型过程极大获利。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 螨虫采集与鉴定 2
1.2 引物准备2
1.3 基因分型4
1.4 方法进一步确认 4
2 数据分析4
3 结果与讨论 4
致谢6
参考文献7
表1 试验用虫相关信息2
表2 试验所用通用引物、染料及微卫星引物分组情况3
图1 三引物系统及多重PCR过程图示3
图 2 XZ04号DNA样品通过不同三种方法同时扩增四个位点所得结果截图（使用3130毛细管电泳仪）5
利用荧光标记通用引物的多重PCR基因分型方法
引言
1989年Litt和Luty初次使用微卫星(SSR)进行分型工作[1]，之后出现了多种适于微卫星等位基因分型的方法。这些方法基于放射性同位素或银染，它们大部分已经被毛细管电泳荧光检测系统取代。毛细管电泳荧光检测系统提供了更快捷实用的方法，引起了革命性的改变。2009到2010年，在Molecular Ecology上发表的关于SSR分型的文章90%运用的是毛细管电泳荧光检测系统[2]。
在一般的毛细管电泳系统中，直接用荧光引物标记一个特殊位点的上游或下游。荧光物质包含在PCR产物中，它可以被 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
毛细管电泳程序检测出，从而可分析PCR产物的长度。然而，这种方法的局限性在于：荧光染料价格昂贵，进行大批量实验室时花费激增。
之后，一种花费较少的方法被开发和不断改进[3–7]。这种方法基于一种通用荧光引物（M13），它被加在每条上游引物的5’端。在PCR循环中，这个通用荧光引物与互补区杂交产生在最初的PCR循环中（见图1）。因此，我们不需要再为每个不同SSR位点合成相应的荧光标记引物，一个三引物系统中只需要一条通用荧光标记引物。
M13序列是运用最广泛的尾巴，对于其他与目的基因组非同源的序列也是有潜在运用价值的。例如：Missiaggia和Grattapaglia用从人类DNA中得到的通用标记DYS437、D8S1132和D12S1090分型了桉树DNA [8]。
理论上，荧光染料标记通用引物的方法可以用来进行多重PCR[6]。此外， Blacket证明了在多重PCR过程中，通过单个通用引物（M13）和单个荧光染料配对的途径，多个位点可以利用四个通用引物连接不同荧光染料达到的共扩增目的[9]。结合多种荧光的多重PCR被证明是最节省的方法 [10–13]。
这里我们拓展了Blacket的概念和方法[9]：在同一个PCR过程中，用结合四个不同颜色的四条通用引物同时对8个、12个甚至更多位点进行分型。
1 材料与方法
1．1 螨虫采集和鉴定
螨虫于2012年在徐州采集(见表1)，叶螨种群用隔离法在菜豆Phaseolus vulgaris叶片上隔离饲养，饲养条件为25±1℃，相对湿度60%，光照周期16L8D。
表1试验用虫相关信息
种群名称
地点
位置
种类
采集时间
分型总数
寄主
XZ
徐州
34°44′N
116°56′E
T. truncatus
2012.07
42
Gossypium hirsutum
因为螨虫个体小且相似，螨虫的鉴定是长期以来困扰人们的问题。本实验室通过形态学方法，即雄虫阳具形状，和分子方法，即基于内转录间隔区（ITS）序列区域测序，对螨虫进行鉴定，鉴定方法精确高效[14]。本实验中螨虫鉴定仍运用以上方法。
1．2 引物准备
从离体叶片上挑取截形叶螨雌虫，按Tsagkarakou等的方法用 DNeasy tissue kit (Qiagen, USA)提取基因组[15]。NanoDrop ND–1000 spectrophotometer检测样品DNA浓度。
用于本试验的12对引物（见表2）是通过Multiplex Manager 1.2从本实验室之前的文章中选出的[14]。引物订购自Life Technologies。每条特定的上游引物都在5’端连有T7 (5’–TAATACGACTCACTATAGGG),M13 (5’–TGTAAAACGACGGCCAGT),M13R (5’–CAGGAAACAGCTATGACC) 或者 AP2 (5’–CTATAGGGCACGCGTGGT) (见表2).通用引物M13、AP2、M13R 和 T7分别连有荧光染料FAM, VIC, NED and PET（见图1）。溶解在TE（10 mM Tris，1mM EDTA中，pH 8.0）中，得到20μM荧光标记的通用引物、20μM位点特异性的下游引物的原液以及5μM位点特异性上游引物与通用尾巴的原液（标记的上游引物：下游引物：染料标记的通用引物=1:4:4[6]）。引物混合物用Ps代表（每个特定位点混合的三条引物被统称为PS，如PTUFG87），PA，PB，PC，PA +B，PA + B + C含有相等体积所对应的PS（见表2），然后分小份在–20℃下等量黑暗保存。
表2试验中所用通用引物、染料及微卫星引物分组情况
种类
微卫星分组
位点（PS）
加在上游引物上的通用引物名称
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 螨虫采集与鉴定 2
1.2 引物准备2
1.3 基因分型4
1.4 方法进一步确认 4
2 数据分析4
3 结果与讨论 4
致谢6
参考文献7
表1 试验用虫相关信息2
表2 试验所用通用引物、染料及微卫星引物分组情况3
图1 三引物系统及多重PCR过程图示3
图 2 XZ04号DNA样品通过不同三种方法同时扩增四个位点所得结果截图（使用3130毛细管电泳仪）5
利用荧光标记通用引物的多重PCR基因分型方法
引言
1989年Litt和Luty初次使用微卫星(SSR)进行分型工作[1]，之后出现了多种适于微卫星等位基因分型的方法。这些方法基于放射性同位素或银染，它们大部分已经被毛细管电泳荧光检测系统取代。毛细管电泳荧光检测系统提供了更快捷实用的方法，引起了革命性的改变。2009到2010年，在Molecular Ecology上发表的关于SSR分型的文章90%运用的是毛细管电泳荧光检测系统[2]。
在一般的毛细管电泳系统中，直接用荧光引物标记一个特殊位点的上游或下游。荧光物质包含在PCR产物中，它可以被 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
毛细管电泳程序检测出，从而可分析PCR产物的长度。然而，这种方法的局限性在于：荧光染料价格昂贵，进行大批量实验室时花费激增。
之后，一种花费较少的方法被开发和不断改进[3–7]。这种方法基于一种通用荧光引物（M13），它被加在每条上游引物的5’端。在PCR循环中，这个通用荧光引物与互补区杂交产生在最初的PCR循环中（见图1）。因此，我们不需要再为每个不同SSR位点合成相应的荧光标记引物，一个三引物系统中只需要一条通用荧光标记引物。
M13序列是运用最广泛的尾巴，对于其他与目的基因组非同源的序列也是有潜在运用价值的。例如：Missiaggia和Grattapaglia用从人类DNA中得到的通用标记DYS437、D8S1132和D12S1090分型了桉树DNA [8]。
理论上，荧光染料标记通用引物的方法可以用来进行多重PCR[6]。此外， Blacket证明了在多重PCR过程中，通过单个通用引物（M13）和单个荧光染料配对的途径，多个位点可以利用四个通用引物连接不同荧光染料达到的共扩增目的[9]。结合多种荧光的多重PCR被证明是最节省的方法 [10–13]。
这里我们拓展了Blacket的概念和方法[9]：在同一个PCR过程中，用结合四个不同颜色的四条通用引物同时对8个、12个甚至更多位点进行分型。
1 材料与方法
1．1 螨虫采集和鉴定
螨虫于2012年在徐州采集(见表1)，叶螨种群用隔离法在菜豆Phaseolus vulgaris叶片上隔离饲养，饲养条件为25±1℃，相对湿度60%，光照周期16L8D。
表1试验用虫相关信息
种群名称
地点
位置
种类
采集时间
分型总数
寄主
XZ
徐州
34°44′N
116°56′E
T. truncatus
2012.07
42
Gossypium hirsutum
因为螨虫个体小且相似，螨虫的鉴定是长期以来困扰人们的问题。本实验室通过形态学方法，即雄虫阳具形状，和分子方法，即基于内转录间隔区（ITS）序列区域测序，对螨虫进行鉴定，鉴定方法精确高效[14]。本实验中螨虫鉴定仍运用以上方法。
1．2 引物准备
从离体叶片上挑取截形叶螨雌虫，按Tsagkarakou等的方法用 DNeasy tissue kit (Qiagen, USA)提取基因组[15]。NanoDrop ND–1000 spectrophotometer检测样品DNA浓度。
用于本试验的12对引物（见表2）是通过Multiplex Manager 1.2从本实验室之前的文章中选出的[14]。引物订购自Life Technologies。每条特定的上游引物都在5’端连有T7 (5’–TAATACGACTCACTATAGGG),M13 (5’–TGTAAAACGACGGCCAGT),M13R (5’–CAGGAAACAGCTATGACC) 或者 AP2 (5’–CTATAGGGCACGCGTGGT) (见表2).通用引物M13、AP2、M13R 和 T7分别连有荧光染料FAM, VIC, NED and PET（见图1）。溶解在TE（10 mM Tris，1mM EDTA中，pH 8.0）中，得到20μM荧光标记的通用引物、20μM位点特异性的下游引物的原液以及5μM位点特异性上游引物与通用尾巴的原液（标记的上游引物：下游引物：染料标记的通用引物=1:4:4[6]）。引物混合物用Ps代表（每个特定位点混合的三条引物被统称为PS，如PTUFG87），PA，PB，PC，PA +B，PA + B + C含有相等体积所对应的PS（见表2），然后分小份在–20℃下等量黑暗保存。
表2试验中所用通用引物、染料及微卫星引物分组情况
种类
微卫星分组
位点（PS）
加在上游引物上的通用引物名称
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