家蚕滞育激素受体信号转导通路的研究
家蚕滞育激素受体信号转导通路的研究[20200507184455]
摘要：家蚕滞育激素受体(BmDHR)被滞育激素(DH)激活后，参与滞育激素信号的转导，在家蚕滞育发动过程中发挥重要作用。将已经构建好的相关家蚕DHR表达载体瞬时转染HEK293细胞及SF21细胞，然后在不同浓度DH刺激下，不同时间分别检测胞内Ca2+、下游第二信使cAMP和MAPK通路的ERK1/2活性。结果显示，BmDHR被DH激活后，能激活腺苷酸环化酶(AC)，促使第二信使cAMP的积累和产生胞内Ca2+流，并表现出DH刺激浓度依赖性；BmDHR能介导ERK1/2磷酸化并也显现出配体浓度和时间梯度的依赖性。结果表明，诱导产生cAMP、Ca2+的胞内第二信使和介导ERK1/2磷酸化可能是BmDHR信号转导的三个通路。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
关键字:滞育激素受体；家蚕；信号通路；G蛋白偶联受体
目录
摘要.1关键词.1 Abstract..........1Key words..1引言.1 1材料与方法..................2 1.1材料 .....................2 1.2试验方法 .........3 1.2.1细胞培养和复苏........3 1.2.2质粒提取....................3 1.2.3细胞转染................4
1.2.4胞内Ca2+检测......................4
1.2.5 cAMP的检测..4
1.2.6 MAPK通路的ERK1/2活性检测：免疫印迹法.4
2结果与分析..........................................................................4
2.1家蚕滞育激素受体介导的Ca2+通路研究..........4
2.2第二信使cAMP的检测..5
2.2家蚕滞育激素受体介导的MAPK通路研究..6
3讨论..............................................7
致谢.....................................................8
参考文献.........................................8
家蚕滞育激素受体信号转导通路的研究
引言
引言
滞育（Diapause）是昆虫在个体发育的某个特定阶段主动停止发育的一种现象，在昆虫的生存、进化、繁育等过程中发挥着重要的作用[1] *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
。家蚕（Bombyx mori）的滞育出现在胚胎发育的早期，为卵滞育型[2]。一般滞育性品种蚕的经济性状优于非滞育性品种蚕的经济性状，蚕卵是否发生滞育，主要取决于蛹期由咽下神经节（Subpharyngeal ganglion，SG）合成和分泌的滞育激素（Diapause hormone，DH）作用[3,4]，因而研究DH作用机制，成为探明与利用家蚕滞育的关键。
家蚕DH最早由Hasegawa于1951年命名并于1957年从家蚕脑-咽下神经节复合体中分离获得[5,6]，1987年Yamashita等提纯了DH，并查明DH是由24个氨基酸组成的多肽，分子量为2645，C末端酰胺化为其活性所必需[7]。DH由DH基因编码，其基因表达有温度控制和发育时期依赖二种类型[8,9]。DH作用是通过其受体来介导的，家蚕滞育激素受体（Diapause hormone receptor, DHR）在家蚕滞育发动过程中起着十分重要的作用，探明DHR信号转导及对胚胎滞育调控的机理，对于了解DH的滞育信号传递方式及其作用机制是必需的。DHR是由436个氨基酸组成的多肽，含有7个跨膜结构域，属于G蛋白偶联受体（G protein coupled receptor, GPCR）大家族，DHR基因表达水平在不同条件催青的二化性品种5龄蚕幼虫、蛹体中存在差异[10]。GPCR是细胞表面受体中数目最大、种类最多的一类高度保守的膜蛋白超级家族，广泛存在于从真菌到哺乳动物的生物体中，都享有一个共同的二级结构特征即7个α-螺旋跨膜结构[11]。GPCR通过与GTP结合蛋白的偶合，调节相关酶活性，在细胞内产生第二信使，将胞外信号跨膜传递到胞内，从而起到改变细胞的功能活性的重要作用 [12,13]。
家蚕是中国5000年前驯化的经济昆虫，如今也已成为生命科学领域中重要的模式生物[14]，但是到目前为止，国内外对于家蚕等昆虫的DHR，仅有一级结构序列分析，尚没有详细的有关结构和功能的构效机制、信号转导的分子机制、内吞和胞内转运路径以及对胚胎滞育调控机理等研究的报道[15-17]。为此，本次毕业实习设想能够进一步研究家蚕DHR信号转导通路，认识和了解家蚕滞育激素作用，为家蚕胚胎滞育诱导、阻止、解除全过程等分子机理方面，做出一些积极的探索和尝试。家蚕也是鳞翅目昆虫的代表，鳞翅目昆虫幼虫大多危害各类栽培植物[18]，因而解明家蚕DHR信号转导的分子机制，能更好的利用这一模式动物进行生命科学和农业科学方面的研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂
DH(上海吉尔)；牛血清白蛋白（BSA）；琼脂；无水氯化钙；乙醇；甲醇；Hanks、PBS、0.25%胰蛋白酶、双抗（吉诺生物）；胎牛血清；全蛋白酶抑制剂X-teremGENE HP DNA Transfection Regant(Roche)；大肠杆菌DH5α、RIPA强裂解液、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）、10%SDS、TEMED、过硫酸铵、预染蛋白质分子量标准、anti-rabbit IgG、HRP-conjugated anti-rabbit IgG、Phospho-p44/42 ERK兔源抗体、p44/42ERK兔源抗体、20xHRP substrat(Cell signaing)；PVDF膜二抗(Millipore)；显影液、定影液、氨苄青 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
霉素、卡纳青霉素、Tween-20、Fura2-AM(同仁生物)；脱脂奶粉(上海光明)。
1.1.2 主要仪器与设备
移液器(Gilson，France；Eppendorf，USA)；XB70制冰机(Grant，USA)；DNP-9082型电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司，上海)；回转式摇床(哈尔滨东联电子技术开发有限公司，黑龙江)；垂直净化工作台(上海博讯事业有限公司，上海)；倒置显微镜、荧光显微镜(OLYMPUS，Japan)；CO2培养箱(Thermo，USA)；HZ-9211K恒温振荡器(太仓市科教仪器厂，江苏)；MLS-3750型高压灭菌锅、80℃低温冰箱、细胞培养箱(Sanyo，Japan)；Tecan Infinite 200多功能酶标仪(Tecan，Switzerland)；蛋白电泳仪、蛋白电泳转印设备(Bio-Rad，USA)；压片暗盒、X光胶片(Kodak)、化学发光检测仪FBl2(Berthold，USA)；TopCount NXT化学发光检测仪(PerkinElmer，USA)；TGL-16G台式离心机(安亭，上海)；14K台式离心机(珠海黑马，珠海)；MiniSpan PluS微型高速离心机(奥盛，杭州)；细胞培养皿、96孔黑底板（corning）；96孔白板（PerkinElmer）。
1.1.3 载体
CRE-Luciferase、BmCRE-Luciferase、Flag-DHR表达载体(实验室自主构建保存)、BmFlag-DHR表达载体(实验室自主构建保存)
1.1.4 细胞株
HEK293、SF21(本实验室冻存)
1.1.5 培养基、缓冲液及其配制
[12] Thomsen W, Frazer J, Unett D. Functional assays for screening GPCR targets. Current Opinion in Biotechnology, 2005, 16:655~665.
摘要：家蚕滞育激素受体(BmDHR)被滞育激素(DH)激活后，参与滞育激素信号的转导，在家蚕滞育发动过程中发挥重要作用。将已经构建好的相关家蚕DHR表达载体瞬时转染HEK293细胞及SF21细胞，然后在不同浓度DH刺激下，不同时间分别检测胞内Ca2+、下游第二信使cAMP和MAPK通路的ERK1/2活性。结果显示，BmDHR被DH激活后，能激活腺苷酸环化酶(AC)，促使第二信使cAMP的积累和产生胞内Ca2+流，并表现出DH刺激浓度依赖性；BmDHR能介导ERK1/2磷酸化并也显现出配体浓度和时间梯度的依赖性。结果表明，诱导产生cAMP、Ca2+的胞内第二信使和介导ERK1/2磷酸化可能是BmDHR信号转导的三个通路。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
关键字:滞育激素受体；家蚕；信号通路；G蛋白偶联受体
目录
摘要.1关键词.1 Abstract..........1Key words..1引言.1 1材料与方法..................2 1.1材料 .....................2 1.2试验方法 .........3 1.2.1细胞培养和复苏........3 1.2.2质粒提取....................3 1.2.3细胞转染................4
1.2.4胞内Ca2+检测......................4
1.2.5 cAMP的检测..4
1.2.6 MAPK通路的ERK1/2活性检测：免疫印迹法.4
2结果与分析..........................................................................4
2.1家蚕滞育激素受体介导的Ca2+通路研究..........4
2.2第二信使cAMP的检测..5
2.2家蚕滞育激素受体介导的MAPK通路研究..6
3讨论..............................................7
致谢.....................................................8
参考文献.........................................8
家蚕滞育激素受体信号转导通路的研究
引言
引言
滞育（Diapause）是昆虫在个体发育的某个特定阶段主动停止发育的一种现象，在昆虫的生存、进化、繁育等过程中发挥着重要的作用[1] *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
。家蚕（Bombyx mori）的滞育出现在胚胎发育的早期，为卵滞育型[2]。一般滞育性品种蚕的经济性状优于非滞育性品种蚕的经济性状，蚕卵是否发生滞育，主要取决于蛹期由咽下神经节（Subpharyngeal ganglion，SG）合成和分泌的滞育激素（Diapause hormone，DH）作用[3,4]，因而研究DH作用机制，成为探明与利用家蚕滞育的关键。
家蚕DH最早由Hasegawa于1951年命名并于1957年从家蚕脑-咽下神经节复合体中分离获得[5,6]，1987年Yamashita等提纯了DH，并查明DH是由24个氨基酸组成的多肽，分子量为2645，C末端酰胺化为其活性所必需[7]。DH由DH基因编码，其基因表达有温度控制和发育时期依赖二种类型[8,9]。DH作用是通过其受体来介导的，家蚕滞育激素受体（Diapause hormone receptor, DHR）在家蚕滞育发动过程中起着十分重要的作用，探明DHR信号转导及对胚胎滞育调控的机理，对于了解DH的滞育信号传递方式及其作用机制是必需的。DHR是由436个氨基酸组成的多肽，含有7个跨膜结构域，属于G蛋白偶联受体（G protein coupled receptor, GPCR）大家族，DHR基因表达水平在不同条件催青的二化性品种5龄蚕幼虫、蛹体中存在差异[10]。GPCR是细胞表面受体中数目最大、种类最多的一类高度保守的膜蛋白超级家族，广泛存在于从真菌到哺乳动物的生物体中，都享有一个共同的二级结构特征即7个α-螺旋跨膜结构[11]。GPCR通过与GTP结合蛋白的偶合，调节相关酶活性，在细胞内产生第二信使，将胞外信号跨膜传递到胞内，从而起到改变细胞的功能活性的重要作用 [12,13]。
家蚕是中国5000年前驯化的经济昆虫，如今也已成为生命科学领域中重要的模式生物[14]，但是到目前为止，国内外对于家蚕等昆虫的DHR，仅有一级结构序列分析，尚没有详细的有关结构和功能的构效机制、信号转导的分子机制、内吞和胞内转运路径以及对胚胎滞育调控机理等研究的报道[15-17]。为此，本次毕业实习设想能够进一步研究家蚕DHR信号转导通路，认识和了解家蚕滞育激素作用，为家蚕胚胎滞育诱导、阻止、解除全过程等分子机理方面，做出一些积极的探索和尝试。家蚕也是鳞翅目昆虫的代表，鳞翅目昆虫幼虫大多危害各类栽培植物[18]，因而解明家蚕DHR信号转导的分子机制，能更好的利用这一模式动物进行生命科学和农业科学方面的研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂
DH(上海吉尔)；牛血清白蛋白（BSA）；琼脂；无水氯化钙；乙醇；甲醇；Hanks、PBS、0.25%胰蛋白酶、双抗（吉诺生物）；胎牛血清；全蛋白酶抑制剂X-teremGENE HP DNA Transfection Regant(Roche)；大肠杆菌DH5α、RIPA强裂解液、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）、10%SDS、TEMED、过硫酸铵、预染蛋白质分子量标准、anti-rabbit IgG、HRP-conjugated anti-rabbit IgG、Phospho-p44/42 ERK兔源抗体、p44/42ERK兔源抗体、20xHRP substrat(Cell signaing)；PVDF膜二抗(Millipore)；显影液、定影液、氨苄青 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
霉素、卡纳青霉素、Tween-20、Fura2-AM(同仁生物)；脱脂奶粉(上海光明)。
1.1.2 主要仪器与设备
移液器(Gilson，France；Eppendorf，USA)；XB70制冰机(Grant，USA)；DNP-9082型电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司，上海)；回转式摇床(哈尔滨东联电子技术开发有限公司，黑龙江)；垂直净化工作台(上海博讯事业有限公司，上海)；倒置显微镜、荧光显微镜(OLYMPUS，Japan)；CO2培养箱(Thermo，USA)；HZ-9211K恒温振荡器(太仓市科教仪器厂，江苏)；MLS-3750型高压灭菌锅、80℃低温冰箱、细胞培养箱(Sanyo，Japan)；Tecan Infinite 200多功能酶标仪(Tecan，Switzerland)；蛋白电泳仪、蛋白电泳转印设备(Bio-Rad，USA)；压片暗盒、X光胶片(Kodak)、化学发光检测仪FBl2(Berthold，USA)；TopCount NXT化学发光检测仪(PerkinElmer，USA)；TGL-16G台式离心机(安亭，上海)；14K台式离心机(珠海黑马，珠海)；MiniSpan PluS微型高速离心机(奥盛，杭州)；细胞培养皿、96孔黑底板（corning）；96孔白板（PerkinElmer）。
1.1.3 载体
CRE-Luciferase、BmCRE-Luciferase、Flag-DHR表达载体(实验室自主构建保存)、BmFlag-DHR表达载体(实验室自主构建保存)
1.1.4 细胞株
HEK293、SF21(本实验室冻存)
1.1.5 培养基、缓冲液及其配制
[12] Thomsen W, Frazer J, Unett D. Functional assays for screening GPCR targets. Current Opinion in Biotechnology, 2005, 16:655~665.
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