从奶样中直接检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的研制
本实验旨在研究一种直接从奶样中检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的检测试剂盒。首先预处理，清除牛奶中大量的蛋白质和脂肪，再通过裂解缓冲液的使用，增加对细胞的破坏，使用带有电荷的磁性微球吸附处理后样品中的核酸并用洗涤液去除杂质，最后通过聚合酶链式反应扩增DNA模板，琼脂核酸电泳检测结果。检测PCR扩增金黄色葡萄球菌和无乳链球菌共同退火温度为53°；试剂盒对含有金黄色葡萄球菌或无乳链球菌菌株奶样以及含非这两种的菌株的奶样进行实验，结果只有含金黄色葡萄球菌或无乳链球菌的样显示结果为阳性；试剂盒对于含金黄色葡萄球菌或无乳链球菌奶样的灵敏度分别是1.64×10 CFU/mL、1×105CFU/mL；试剂盒保存期至少半年，不影响其使用效果；用试剂盒对奶样进行反复检测实验，均得到阳性结果。综上所诉，直接从奶样中检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒，特异性强、灵敏度高、稳定性好，并能大大缩短检测时间，提高奶样检测效率，适用于临床乳房炎奶样的快速检测。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言（或绪论 2
1实验材料 2
1.1材料 3
1.2主要试剂 3
1.3主要仪器 3
1.4菌株 3
1.5引物 3
2 实验方法 3
2.1直接从奶样中提取金黄色葡萄球菌和无乳链球菌核酸的方法 3
2.1.1试剂的配置 3
2.1.2实验方法 4
2.2 PCR退火温度的确定 4
2.3检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的特异性 4
2.4检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的敏感性 4
2.5检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的有效性 5
2.5.1传统检测方法 5
2.5.2有效性检查 5
2.6检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒重复性检测 5
2.7检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的保存期 5
2.8金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的组装 5
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验结果与分析 5
3.1 金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的PCR退火温度的确定 5
3.2检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的特异性 7
3.3检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的敏感性 8
3.4检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的有效性 8
3.5检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的保存期 9
3.6金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的组装 9
4 讨论 10
4.1直接从奶样中提取金黄色葡萄球菌和无乳链球菌核酸方法10
4.2直接从奶样中检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的检测试剂盒可行性10
致谢 11
参考文献 11 直接从奶样中检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌 检测试剂盒的研制
引言
奶牛乳房炎是奶牛的多发病，也是引起奶牛业发展的重要疾病之一，能引起产奶量及其品质下降，造成严重的经济损失[1]。常见的致病菌有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌等。
金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌之一，也是临床上最难治愈并造成经济损失最大的致病菌，可导致各种化脓性疾病、乳房炎、败血症等,约有 50% 的乳房炎是由该细菌引起的[2]。又因抗生素的长期使用致使病原菌对其产生了耐药性，从而给奶牛乳房炎的治疗带来困难。无乳链球菌也是牛群中乳腺炎的重要传染性病原菌，对规模饲养的奶牛，其危害是相当严重的。据报道，无乳链球菌可引起新生儿败血症、脑膜炎、呼吸道和妇女生殖感染等[3]。
因此，一种快速高效的检测方法是十分有必要的，本研究在于可以快速直接从奶液中提取金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的核酸；大大缩短了检测时间，而且相比于传统细菌检测方法，本发明在准确性和敏感性上也有所提高[4]。为奶牛乳房炎的检测提供了一个更加高效、准确、敏感的检测方法。
在检测细菌上，国内外传统乳房炎病原菌的检测是通过细菌培养、生化反应或是免疫学诊断来确定，虽然较为准确，但由于需专人操作、周期长，成本高等因素，难以满足临床检验需求[5]。近年来，随着分子生物学的发展，PCR技术在检测致病菌方面得以广泛应用,并且展现出其快速、特异的优势和前景。国内外对无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的检测方法已有一定的相关研究基础[6]。他们利用已知无乳链球菌和金黄色葡萄球菌16sRNA序列设计特异性引物,通过PCR方法鉴定[7]。然而对于病原微生物的分子检测是建立在目标DNA扩增基础上的。因此，高效提取DNA致病细菌是一个重要的步骤，我们旨在提供一种特定的、灵敏的、快速的检测试剂盒，可直接从奶样中提取主要乳房炎致病菌的DNA。
目前病原微生物的分子检测已经逐渐应用于临床实践中，而病原微生物的分子检测是建立在目标DNA扩增基础上的。因此，高效提取DNA致病细菌是一个重要的步骤。但现在临床检测中还没有直接从奶样中检测细菌的检测试剂盒，因此实验旨在开发一种特定的、灵敏的、快速的检测试剂盒可直接从奶样中检测金黄色葡萄球菌盒无乳链球菌就显得十分必要。
1 实验材料
1.1 实验材料
送检奶样（来自江苏、安徽、呼和浩特等地的发病奶牛场）
1.2 主要试剂
Nacl(江苏强盛功能化学股份有限公司)、guanidine thiocyanat(合肥博美生物科技有限责任公司）、EDTA Na2(南京鼎思生物技术有限公司)、TrisHCl(南京鼎思生物技术有限公司）、Triton X100(南京鼎思生物技术有限公司）、DTT(DLdithiothreitol合肥博美生物科技有限责任公司）、无水乙醇（广州光华科技股份有限公司）、异丙醇（天津市科密欧化学试剂有限公司）、Affimag SLE磁性微球（天津市倍思乐色谱技术开发中心）、GoldViewTMNucleic Acid Stain(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)、Trans2K Plus DNA Marker、麦康凯琼脂（青岛高科园海博生物技术有限公司）快速革兰氏染色液（珠海贝索生物技术有限公司）、新生牛血清（浙江天航生物科技股份有限公司）
1.3 主要仪器
电子天平（梅特勒托利多仪器（上海）有限公司）
PH检测仪（美国精骐有限公司）
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言（或绪论 2
1实验材料 2
1.1材料 3
1.2主要试剂 3
1.3主要仪器 3
1.4菌株 3
1.5引物 3
2 实验方法 3
2.1直接从奶样中提取金黄色葡萄球菌和无乳链球菌核酸的方法 3
2.1.1试剂的配置 3
2.1.2实验方法 4
2.2 PCR退火温度的确定 4
2.3检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的特异性 4
2.4检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的敏感性 4
2.5检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的有效性 5
2.5.1传统检测方法 5
2.5.2有效性检查 5
2.6检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒重复性检测 5
2.7检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的保存期 5
2.8金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的组装 5
3 实 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
验结果与分析 5
3.1 金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的PCR退火温度的确定 5
3.2检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的特异性 7
3.3检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的敏感性 8
3.4检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的有效性 8
3.5检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的保存期 9
3.6金黄色葡萄球菌和无乳链球菌检测试剂盒的组装 9
4 讨论 10
4.1直接从奶样中提取金黄色葡萄球菌和无乳链球菌核酸方法10
4.2直接从奶样中检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的检测试剂盒可行性10
致谢 11
参考文献 11 直接从奶样中检测金黄色葡萄球菌和无乳链球菌 检测试剂盒的研制
引言
奶牛乳房炎是奶牛的多发病，也是引起奶牛业发展的重要疾病之一，能引起产奶量及其品质下降，造成严重的经济损失[1]。常见的致病菌有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌等。
金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌之一，也是临床上最难治愈并造成经济损失最大的致病菌，可导致各种化脓性疾病、乳房炎、败血症等,约有 50% 的乳房炎是由该细菌引起的[2]。又因抗生素的长期使用致使病原菌对其产生了耐药性，从而给奶牛乳房炎的治疗带来困难。无乳链球菌也是牛群中乳腺炎的重要传染性病原菌，对规模饲养的奶牛，其危害是相当严重的。据报道，无乳链球菌可引起新生儿败血症、脑膜炎、呼吸道和妇女生殖感染等[3]。
因此，一种快速高效的检测方法是十分有必要的，本研究在于可以快速直接从奶液中提取金黄色葡萄球菌和无乳链球菌的核酸；大大缩短了检测时间，而且相比于传统细菌检测方法，本发明在准确性和敏感性上也有所提高[4]。为奶牛乳房炎的检测提供了一个更加高效、准确、敏感的检测方法。
在检测细菌上，国内外传统乳房炎病原菌的检测是通过细菌培养、生化反应或是免疫学诊断来确定，虽然较为准确，但由于需专人操作、周期长，成本高等因素，难以满足临床检验需求[5]。近年来，随着分子生物学的发展，PCR技术在检测致病菌方面得以广泛应用,并且展现出其快速、特异的优势和前景。国内外对无乳链球菌和金黄色葡萄球菌的检测方法已有一定的相关研究基础[6]。他们利用已知无乳链球菌和金黄色葡萄球菌16sRNA序列设计特异性引物,通过PCR方法鉴定[7]。然而对于病原微生物的分子检测是建立在目标DNA扩增基础上的。因此，高效提取DNA致病细菌是一个重要的步骤，我们旨在提供一种特定的、灵敏的、快速的检测试剂盒，可直接从奶样中提取主要乳房炎致病菌的DNA。
目前病原微生物的分子检测已经逐渐应用于临床实践中，而病原微生物的分子检测是建立在目标DNA扩增基础上的。因此，高效提取DNA致病细菌是一个重要的步骤。但现在临床检测中还没有直接从奶样中检测细菌的检测试剂盒，因此实验旨在开发一种特定的、灵敏的、快速的检测试剂盒可直接从奶样中检测金黄色葡萄球菌盒无乳链球菌就显得十分必要。
1 实验材料
1.1 实验材料
送检奶样（来自江苏、安徽、呼和浩特等地的发病奶牛场）
1.2 主要试剂
Nacl(江苏强盛功能化学股份有限公司)、guanidine thiocyanat(合肥博美生物科技有限责任公司）、EDTA Na2(南京鼎思生物技术有限公司)、TrisHCl(南京鼎思生物技术有限公司）、Triton X100(南京鼎思生物技术有限公司）、DTT(DLdithiothreitol合肥博美生物科技有限责任公司）、无水乙醇（广州光华科技股份有限公司）、异丙醇（天津市科密欧化学试剂有限公司）、Affimag SLE磁性微球（天津市倍思乐色谱技术开发中心）、GoldViewTMNucleic Acid Stain(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)、Trans2K Plus DNA Marker、麦康凯琼脂（青岛高科园海博生物技术有限公司）快速革兰氏染色液（珠海贝索生物技术有限公司）、新生牛血清（浙江天航生物科技股份有限公司）
1.3 主要仪器
电子天平（梅特勒托利多仪器（上海）有限公司）
PH检测仪（美国精骐有限公司）
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