小分子试剂抑制猪瘟病毒入胞的初步研究
小分子试剂抑制猪瘟病毒入胞的初步研究[20200507190030]
摘要：病毒必须依赖细胞进行自我的复制，复制的过程分为吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配释放五个步骤。本试验应用肝素钠、甲基-β-环糊精、氯喹和氯丙嗪等小分子试剂，研究了猪瘟病毒石门株入胞的细节，结果表明1μM的肝素钠与100TCID50的石门株病毒共孵育后，肝素钠能够结合病毒减少入胞的病毒量，导致胞内病毒的减少；0.5mM的甲基-β-环糊精或者50μM的氯喹预先处理PK-15细胞；1mM的甲基-β-环糊精或者25μM的氯喹预先处理ST细胞后，均能够抑制猪瘟病毒的入胞，从而减少胞内繁殖的病毒同时研究表明上述小分子试剂对猪瘟病毒入胞的抑制均呈剂量依赖性。而用10、20、30、40 μM 的氯丙嗪处理ST细胞 1 h，再加入病毒感染均不影响病毒的入侵。本研究为猪瘟病毒的入胞机制和设计抗病毒药物提供实验依据。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:猪瘟病毒；肝素钠；甲基-β-环糊精；氯喹；病毒入胞
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 4
1．1材料 4
1．1．1细胞株与病毒 4
1．1．2主要试剂 4
1．1．3主要仪器 4
1．2实验方法 4
1．2．1细胞培养 4
1．2．2细胞铺板 5
1．2．3 MTT法测药物对细胞的毒性 5
1．2．4．1肝素钠抑制病毒增殖实验 5
1．2．4．2甲基-β-环糊精、氯喹、氯丙嗪抑制病毒增殖实验 5
1．2．5病毒RNA提取、逆转录与荧光定量 5
1．2．5．1病毒RNA提取 5
1．2．5．2 逆转录获得CDNA 6
1．2．5．3 Real Time PCR检测猪瘟病毒载量 6
2 结果与分析 7
2．1 MTT法检测各个药物的细胞毒性 7
2．2肝素钠抗猪瘟病毒入侵实验 8
2．3甲基-β-环糊精抗猪瘟病毒实验 9
2．4 氯喹抗猪瘟病毒实验 9
2．5盐酸氯丙嗪抗猪瘟病毒实验 9
3 讨论 10
3．1 肝素钠抑制猪瘟病毒的侵入 10
3．2 甲基-β-环糊精阻碍猪瘟病毒的入胞 10
3．3 氯喹阻碍猪瘟病毒的入胞 10
3．4 氯丙嗪不影响猪瘟病毒的入胞 10
致谢 11
参考文献： 11
小分子试剂抑制猪瘟病毒入胞的初步研究
引言 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
r /> 猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一类高度接触性传染病，国际兽医局（OIE）将其列为A 类15种法定传染病之一，在中国也被列为一类传染病[1]。该病毒属于黄病毒科( Flaviviridae) 瘟病毒属( Pestivirus)，是有囊膜的正链RNA病毒[2-4]。CSFV基因组编码4个结构蛋白（C、E0、E1、E2）以及至少7个非结构蛋白（Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）[5-8]。目前，全世界约有50个国家和地区发生猪瘟，给世界养猪业带来了巨大的经济损失[9]。除疫苗免疫预防，目前尚无有效的方式可以控制该病的感染，因此寻求一种有效的抗猪瘟病毒感染和治疗猪瘟的方法一直是研究的热点。
猪瘟病毒是有囊膜的正链RNA病毒，而大多数包膜病毒与靶细胞结合以后利用细胞内吞方式作为侵入宿主细胞的途径，这些内吞途径包括：网格蛋白介导的内吞（Clathrin-mediated endocytosis）、膜穴样凹陷介导的内吞（Caveola-mediated endocytosis）、巨胞饮作用（Macropinocytosis）、网格蛋白、膜穴样凹陷非依赖型内吞（Clathrin-and Caveola-independent endocytosis）[10]。目前尚未见有关猪瘟入胞途径系统的研究。本实验以PK-15和ST细胞为研究对象，针对猪瘟病毒石门株的入胞过程，选用甲基-β-环糊精、氯喹和氯丙嗪分别抑制膜穴样凹陷依赖的途径、细胞自噬和网格蛋白介导的内吞途径；24h后利用荧光定量PCR检测各实验组病毒的相对含量，通过比较阻断效果初步探究猪瘟病毒石门株的入胞机制。甲基-β-环糊精为胆固醇抽提剂，其处理细胞后可去除胆固醇，从而破坏脂伐结构，阻断膜穴样凹陷介导的内吞作用[11-12]。自噬是一种进化保守的溶酶体依赖的自身降解途径，是细胞在遇到应激反应等刺激时，将细胞质内多余的蛋白质或损伤的细胞器等物质包绕至自噬体中并与溶酶体结合将其降解的过程[24]。氯喹本身具有弱碱性，同时具有趋溶酶体的特性，其可以选择性地进入溶酶体内，抑制细胞自噬(autophagy)[13]。氯丙嗪可以抑制网格蛋白接毒的内吞途径[14]。
同时，本试验还利用肝素钠与病毒共孵育后混合物接毒，24h后做荧光定量PCR，通过观察各组病毒基因组的相对含量变化来验证猪瘟石门株可以利用ST细胞和PK -15细胞上的硫酸乙酰肝素受体[15-16]。通过以上实验初步探索这4种小分子物质对猪瘟病毒石门株入胞的影响，为研究猪瘟病毒石门株的入胞机制和抗病毒小分子试剂提供了实验依据。
1 材料与方法
1．1材料
1．1．1细胞株与病毒
ST细胞（猪睾丸细胞）、PK-15细胞（猪肾细胞）由本实验室保存在液氮中，猪瘟病毒石门株购自中国兽药监察所，本实验室保存。
1．1．2主要试剂
Q RT SuperMix for qPCR，南京天为生物科技有限公司；DMEM，GIBCO，美国；小牛血清，GIBCO，美国；凯基MTT细胞增殖/毒性检测试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司；SYBR? Premix Ex TaqTM II，TaKaRa，日本；RNA *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
Free H2O，南京鼎国生物技术有限公司；肝素钠，南京天为生物科技有限公司；甲基-β-环糊精，Sigma公司；盐酸氯丙嗪，Sigma公司；氯喹，Sigma公司；其他试剂均为进口或国产分析纯。
1．1．3主要仪器；
ZDX-35BI型自动电热压力蒸汽高压锅，上海申安医疗器械厂，中国；恒温循环水浴锅，重庆科学仪器厂，中国；台式高速冷冻离心机，BECKMAN，美国；BCM-1000A型生物洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司，中国；TP600型PCR 仪，TAKARA，日本；37081型倒置显微镜，Zeiss，德国；实时PCR系统7300，Applied Biosystems，美国；ELx800型吸收光酶标仪，BioTek，美国；
1．2实验方法
1．2．1细胞培养
细胞复苏：将从液氮罐中取出的细胞迅速在40℃水中顺时针不断搅动使其融化，待完全融化后1000rpm 离心5min，弃去冻存液，加入新鲜的培养液悬浮细胞沉淀后将细胞转移至加有新鲜培养液的培养瓶中进行培养，复苏后24h换液。
细胞培养：猪睾丸细胞（ST）用高糖DMEM全培液（含100 U/ml青霉素、100 μg/ml 链霉素及8%灭活胎牛血清）培养，置于37℃、5% CO2孵箱中培养，并利用超纯水来维持培养环境的饱和湿度。
细胞消化：取待传代的细胞，弃去培养基，用37℃预温的0.1%的胰酶胰酶洗涤3遍；留少许胰酶覆盖细胞层，培养箱放置约2min左右；弃去胰酶，加少量新鲜培养基终止消化，用移液管轻轻吹打，显微镜下观察细胞分散为单个后传代。
在PCR仪上反转录，条件如下：
25℃ 10min
42℃ 30min
85℃ 5min
1．2．5．3 Real Time PCR检测猪瘟病毒载量
荧光定量检测猪瘟的引物由L.J.Pérez et al[17]参考猪瘟病毒NS5B设计，内参引物由李玉保等[18]根据猪3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogease gene，GAPDH）的基因序列设计。引物序列如下：
摘要：病毒必须依赖细胞进行自我的复制，复制的过程分为吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配释放五个步骤。本试验应用肝素钠、甲基-β-环糊精、氯喹和氯丙嗪等小分子试剂，研究了猪瘟病毒石门株入胞的细节，结果表明1μM的肝素钠与100TCID50的石门株病毒共孵育后，肝素钠能够结合病毒减少入胞的病毒量，导致胞内病毒的减少；0.5mM的甲基-β-环糊精或者50μM的氯喹预先处理PK-15细胞；1mM的甲基-β-环糊精或者25μM的氯喹预先处理ST细胞后，均能够抑制猪瘟病毒的入胞，从而减少胞内繁殖的病毒同时研究表明上述小分子试剂对猪瘟病毒入胞的抑制均呈剂量依赖性。而用10、20、30、40 μM 的氯丙嗪处理ST细胞 1 h，再加入病毒感染均不影响病毒的入侵。本研究为猪瘟病毒的入胞机制和设计抗病毒药物提供实验依据。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:猪瘟病毒；肝素钠；甲基-β-环糊精；氯喹；病毒入胞
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 4
1．1材料 4
1．1．1细胞株与病毒 4
1．1．2主要试剂 4
1．1．3主要仪器 4
1．2实验方法 4
1．2．1细胞培养 4
1．2．2细胞铺板 5
1．2．3 MTT法测药物对细胞的毒性 5
1．2．4．1肝素钠抑制病毒增殖实验 5
1．2．4．2甲基-β-环糊精、氯喹、氯丙嗪抑制病毒增殖实验 5
1．2．5病毒RNA提取、逆转录与荧光定量 5
1．2．5．1病毒RNA提取 5
1．2．5．2 逆转录获得CDNA 6
1．2．5．3 Real Time PCR检测猪瘟病毒载量 6
2 结果与分析 7
2．1 MTT法检测各个药物的细胞毒性 7
2．2肝素钠抗猪瘟病毒入侵实验 8
2．3甲基-β-环糊精抗猪瘟病毒实验 9
2．4 氯喹抗猪瘟病毒实验 9
2．5盐酸氯丙嗪抗猪瘟病毒实验 9
3 讨论 10
3．1 肝素钠抑制猪瘟病毒的侵入 10
3．2 甲基-β-环糊精阻碍猪瘟病毒的入胞 10
3．3 氯喹阻碍猪瘟病毒的入胞 10
3．4 氯丙嗪不影响猪瘟病毒的入胞 10
致谢 11
参考文献： 11
小分子试剂抑制猪瘟病毒入胞的初步研究
引言
r /> 猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一类高度接触性传染病，国际兽医局（OIE）将其列为A 类15种法定传染病之一，在中国也被列为一类传染病[1]。该病毒属于黄病毒科( Flaviviridae) 瘟病毒属( Pestivirus)，是有囊膜的正链RNA病毒[2-4]。CSFV基因组编码4个结构蛋白（C、E0、E1、E2）以及至少7个非结构蛋白（Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）[5-8]。目前，全世界约有50个国家和地区发生猪瘟，给世界养猪业带来了巨大的经济损失[9]。除疫苗免疫预防，目前尚无有效的方式可以控制该病的感染，因此寻求一种有效的抗猪瘟病毒感染和治疗猪瘟的方法一直是研究的热点。
猪瘟病毒是有囊膜的正链RNA病毒，而大多数包膜病毒与靶细胞结合以后利用细胞内吞方式作为侵入宿主细胞的途径，这些内吞途径包括：网格蛋白介导的内吞（Clathrin-mediated endocytosis）、膜穴样凹陷介导的内吞（Caveola-mediated endocytosis）、巨胞饮作用（Macropinocytosis）、网格蛋白、膜穴样凹陷非依赖型内吞（Clathrin-and Caveola-independent endocytosis）[10]。目前尚未见有关猪瘟入胞途径系统的研究。本实验以PK-15和ST细胞为研究对象，针对猪瘟病毒石门株的入胞过程，选用甲基-β-环糊精、氯喹和氯丙嗪分别抑制膜穴样凹陷依赖的途径、细胞自噬和网格蛋白介导的内吞途径；24h后利用荧光定量PCR检测各实验组病毒的相对含量，通过比较阻断效果初步探究猪瘟病毒石门株的入胞机制。甲基-β-环糊精为胆固醇抽提剂，其处理细胞后可去除胆固醇，从而破坏脂伐结构，阻断膜穴样凹陷介导的内吞作用[11-12]。自噬是一种进化保守的溶酶体依赖的自身降解途径，是细胞在遇到应激反应等刺激时，将细胞质内多余的蛋白质或损伤的细胞器等物质包绕至自噬体中并与溶酶体结合将其降解的过程[24]。氯喹本身具有弱碱性，同时具有趋溶酶体的特性，其可以选择性地进入溶酶体内，抑制细胞自噬(autophagy)[13]。氯丙嗪可以抑制网格蛋白接毒的内吞途径[14]。
同时，本试验还利用肝素钠与病毒共孵育后混合物接毒，24h后做荧光定量PCR，通过观察各组病毒基因组的相对含量变化来验证猪瘟石门株可以利用ST细胞和PK -15细胞上的硫酸乙酰肝素受体[15-16]。通过以上实验初步探索这4种小分子物质对猪瘟病毒石门株入胞的影响，为研究猪瘟病毒石门株的入胞机制和抗病毒小分子试剂提供了实验依据。
1 材料与方法
1．1材料
1．1．1细胞株与病毒
ST细胞（猪睾丸细胞）、PK-15细胞（猪肾细胞）由本实验室保存在液氮中，猪瘟病毒石门株购自中国兽药监察所，本实验室保存。
1．1．2主要试剂
Q RT SuperMix for qPCR，南京天为生物科技有限公司；DMEM，GIBCO，美国；小牛血清，GIBCO，美国；凯基MTT细胞增殖/毒性检测试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司；SYBR? Premix Ex TaqTM II，TaKaRa，日本；RNA *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
Free H2O，南京鼎国生物技术有限公司；肝素钠，南京天为生物科技有限公司；甲基-β-环糊精，Sigma公司；盐酸氯丙嗪，Sigma公司；氯喹，Sigma公司；其他试剂均为进口或国产分析纯。
1．1．3主要仪器；
ZDX-35BI型自动电热压力蒸汽高压锅，上海申安医疗器械厂，中国；恒温循环水浴锅，重庆科学仪器厂，中国；台式高速冷冻离心机，BECKMAN，美国；BCM-1000A型生物洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司，中国；TP600型PCR 仪，TAKARA，日本；37081型倒置显微镜，Zeiss，德国；实时PCR系统7300，Applied Biosystems，美国；ELx800型吸收光酶标仪，BioTek，美国；
1．2实验方法
1．2．1细胞培养
细胞复苏：将从液氮罐中取出的细胞迅速在40℃水中顺时针不断搅动使其融化，待完全融化后1000rpm 离心5min，弃去冻存液，加入新鲜的培养液悬浮细胞沉淀后将细胞转移至加有新鲜培养液的培养瓶中进行培养，复苏后24h换液。
细胞培养：猪睾丸细胞（ST）用高糖DMEM全培液（含100 U/ml青霉素、100 μg/ml 链霉素及8%灭活胎牛血清）培养，置于37℃、5% CO2孵箱中培养，并利用超纯水来维持培养环境的饱和湿度。
细胞消化：取待传代的细胞，弃去培养基，用37℃预温的0.1%的胰酶胰酶洗涤3遍；留少许胰酶覆盖细胞层，培养箱放置约2min左右；弃去胰酶，加少量新鲜培养基终止消化，用移液管轻轻吹打，显微镜下观察细胞分散为单个后传代。
在PCR仪上反转录，条件如下：
25℃ 10min
42℃ 30min
85℃ 5min
1．2．5．3 Real Time PCR检测猪瘟病毒载量
荧光定量检测猪瘟的引物由L.J.Pérez et al[17]参考猪瘟病毒NS5B设计，内参引物由李玉保等[18]根据猪3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogease gene，GAPDH）的基因序列设计。引物序列如下：
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/dwyx/1101.html
