通过荧光定量pcr检测ⅱ型ⅹ型胶原在股骨头坏死中的表达
1本试验采用甲泼尼龙诱导建立肉鸡股骨头坏死（femoral head necrosis，FHN）模型，来研究FHN对于生长板内Ⅱ型、Ⅹ型胶原基因表达量的影响。60羽1日龄健康Ross308肉鸡经1周预饲后随机分为2组，每组30羽，每组3个重复。预饲期结束后，从8日龄开始，试验组每天胸肌肌肉注射甲泼尼龙(20mg/kg/d)，对照组肉鸡注射等量无菌生理盐水，连续注射7d。于43日龄时采集组织样本，测定相关指标变化。结果显示，与对照组比较，试验组肉鸡体重、骨密度、骨强度均极显著降低(P<0.01)，生长板中Ⅱ型胶原基因表达量极显著下降(P<0.01)，而Ⅹ型胶原蛋白表达显著上升(P<0.05)。这表明，甲泼尼龙通过影响肉鸡生长板Ⅱ型、Ⅹ型胶原的表达，从而诱导建立了肉鸡股骨头坏死的模型。
目录
引言
引言 股骨头坏死（femoral head necrosis，FHN）是当前肉鸡养殖业中最常见，最重要的腿病之一。罹患FHN的肉鸡死亡率超过5%，跛行肉鸡FHN检出率最高可达50%，给世界肉鸡养殖业造成相当可观的经济损失[1]。肉鸡FHN可分为两大类，创伤导致的FHN和非创伤性FHN。 其中非创伤性FHN常常是多种因素相互影响共同作用的结果，其发病机制至今尚未形成定论。近年来许多研究表明非创伤性FHN 的发生与一些胶原蛋白表达的变化关系密切[2]。
软骨细胞是股骨头生长板和关节软骨内唯一的细胞成分。软骨细胞按形态差异可分为三类，即圆形软骨细胞、扁平软骨细胞和肥大软骨细胞。前两类软骨细胞都表达Ⅱ型胶原蛋白，而肥大软骨细胞表达Ⅹ型胶原蛋白并将周围的基质逐渐钙化[3]。
目前关于比较患非创伤性FHN肉鸡和健康肉鸡生长板中胶原表达量的变化的研究报道还较少见，为此，本试验研究以Ⅱ型、Ⅹ型胶原蛋白为目标，通过荧光定量PCR技术，比较了两种蛋白在健康鸡和患病鸡中表达差异，旨在探究非创伤性FHN对软骨生长板中胶原表达量的影响，从而为阐明肉鸡FHN发病机理以及提高腿病的防治水平提供理论基础。
1 材料
1．1 试剂
甲泼尼龙（安徽华源制药有限公司，中国）；Trizol试剂（Invitorgen，USA）、cDNA Synthesis Kit (MMLV Version)和SYBR *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
Premix Ex TaqTM试剂盒购于宝生物工程大连有限公司；核酸分子量标准DNA Marker I（天根，南京）。
1．2 仪器
X射线机（北京万东）；骨强度测定仪（LR10K PLUS, Lloyd Instruments Ltd., Hampshire, 英国)；PCR扩增仪（PE240，Perkin Applied Biosystems，德国）；实时荧光定量PCR仪（ABI7300，国华电器有限公司）等。
1．3 试验动物
于安徽嘉吉中国动物蛋白部购买1日龄Ross308肉鸡60羽。随即分成试验组和对照组，每组30羽，每组3个重复。预饲1周。期间严格温度控制：最初两天温度维持在35 ℃，之后在1周内逐渐降到21 ℃，并一直维持该温度至试验结束。在试验开始1周内保持湿度55%，1周后降至45%直至实验结束。每天光照23 h，黑暗1 h。饲喂滁州正大的商品雏鸡料（代谢能：13.39 MJ/kg，粗蛋白23.0 %）。试验期间自由采食和饮水。预饲期结束后，从8日龄开始，试验组每天胸肌肌肉注射甲泼尼龙(20mg/kg/d)，对照组肉鸡注射等量无菌生理盐水，连续注射7 d。
2 试验方法
2．1 样品的采集
试验鸡42日龄时，将每羽肉鸡进行编号、称重。将肉鸡仰卧位保定，剪开腹股沟处皮肤，按压膝关节部位，使股骨头从髋臼中暴露出来，根据股骨头形态进行FHN评分[46]。FHN评分标准见表1。将两侧胫骨、股骨、肱骨取下分别装入自封袋中，20 ℃保存，用于测定骨指数、骨密度、生物力学等指标。用手术刀沿矢状面将股骨头切开，一半样品放入冻存管中，70 ℃保存，用于测定相关基因表达量；另一半浸入4 ℃预冷的4 %多聚甲醛中，在4 ℃环境下浸泡48 h，用于组织学检查。
表1 FHN评分标准
Table 1 The standard for evaluation of FHN score
FHN评分
临床解剖表现
0
股骨头有白色关节软骨覆盖，没有任何损伤
1
股骨头上软骨缺失，部分生长板和软骨一起保留在髋臼内，干骺端有局部组织损伤
2
干骺端大面积损坏，发生骨坏死，甚至存在骨折
2．2 骨生长发育指标的测定
2．2．1 骨放射密度的检测 将肱骨、股骨、胫骨样本与16级铝阶（英国Roslin研究所馈赠）置于同一暗盒上，进行拍片。肱骨、股骨、胫骨采用前后位拍摄。摄片条件：焦点胶片距（FFD）80 cm, 球管电压44 kV，3.88 mAs。CR系统扫描获取图像。用NIH Image J 1.32j图像处理系统分析扫描图像。骨骼样本的放射密度用毫米铝阶厚度（mmAl）表示。
2．2．2 骨强度的检测 用三点弯曲试验检测骨强度。在骨骼样本的中点处标记，用游标卡尺测量每根骨样本此处的直径。根据骨骼样本长度确定跨距。骨强度测定仪测定骨骼强度。预载荷速度设为3mm/min，骨骼断裂时停止。通过NEXYGEN PLUS软件（Lloyd Instruments）分析曲线的最高点即为骨强度（用N表示）。
2．3 实时荧光定量PCR测定相关基因mRNA相对表达量
2．3．1 RNA提取前准备 RNAse free water：将1 mL DEPC与1.0 L 去离子水充分混匀，37 ℃摇床避光过夜。次日取出高压，分装。用品RNAse free处理：将1 mL DEPC与1.0 L 去离子水充分混匀，37 ℃摇床避光过夜。次日将吸头台、枪头、镊子、离心管等均小心一个一个放入水中，保证没有气泡，37 ℃摇床避光过夜。次日高压，将浸泡物品取出，烘干备用。
2．3．2 RNA提取步骤 ①将70 ℃保存的股骨头组织取出约100 mg；②将其移入2 mL EP管中，并加入1 mL Trizol，用手术剪将其尽量剪碎，后用手动匀浆仪在冰上将组织匀浆至透明均质溶液，室温静置5 min，使细胞充分裂解；③12,000 g，4 ℃离心5 min；④将上清移入新离心管中，按1：5体积（氯仿：Trizol，V/V）加入200 μL氯仿；⑤剧烈震荡1 min，室温静置5 min，使蛋白和核酸充分分离后，12,000 g，4 ℃离心15 min；⑥将上层水相转入新的1.5 mL EP管中，加入等体积预冷异丙醇，混匀后室温放置10 ~ 15 min，12,000 g，4 ℃离心10 min；⑦弃上清之后，加入1 mL现配75 %的预冷乙醇溶液，混匀；7,500 g，4 ℃离心5 min，弃上清，重复此步骤2 ~ 3次；⑧弃上清之后，沉淀置超净台干燥约10 min，加入10 ~ 20 μL DEPC水完全溶解；⑨用核酸蛋白检测仪测定总RNA浓度和纯度，使A260/A280需要保持在1.8 ~ 2.0。
目录
引言
引言 股骨头坏死（femoral head necrosis，FHN）是当前肉鸡养殖业中最常见，最重要的腿病之一。罹患FHN的肉鸡死亡率超过5%，跛行肉鸡FHN检出率最高可达50%，给世界肉鸡养殖业造成相当可观的经济损失[1]。肉鸡FHN可分为两大类，创伤导致的FHN和非创伤性FHN。 其中非创伤性FHN常常是多种因素相互影响共同作用的结果，其发病机制至今尚未形成定论。近年来许多研究表明非创伤性FHN 的发生与一些胶原蛋白表达的变化关系密切[2]。
软骨细胞是股骨头生长板和关节软骨内唯一的细胞成分。软骨细胞按形态差异可分为三类，即圆形软骨细胞、扁平软骨细胞和肥大软骨细胞。前两类软骨细胞都表达Ⅱ型胶原蛋白，而肥大软骨细胞表达Ⅹ型胶原蛋白并将周围的基质逐渐钙化[3]。
目前关于比较患非创伤性FHN肉鸡和健康肉鸡生长板中胶原表达量的变化的研究报道还较少见，为此，本试验研究以Ⅱ型、Ⅹ型胶原蛋白为目标，通过荧光定量PCR技术，比较了两种蛋白在健康鸡和患病鸡中表达差异，旨在探究非创伤性FHN对软骨生长板中胶原表达量的影响，从而为阐明肉鸡FHN发病机理以及提高腿病的防治水平提供理论基础。
1 材料
1．1 试剂
甲泼尼龙（安徽华源制药有限公司，中国）；Trizol试剂（Invitorgen，USA）、cDNA Synthesis Kit (MMLV Version)和SYBR *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
Premix Ex TaqTM试剂盒购于宝生物工程大连有限公司；核酸分子量标准DNA Marker I（天根，南京）。
1．2 仪器
X射线机（北京万东）；骨强度测定仪（LR10K PLUS, Lloyd Instruments Ltd., Hampshire, 英国)；PCR扩增仪（PE240，Perkin Applied Biosystems，德国）；实时荧光定量PCR仪（ABI7300，国华电器有限公司）等。
1．3 试验动物
于安徽嘉吉中国动物蛋白部购买1日龄Ross308肉鸡60羽。随即分成试验组和对照组，每组30羽，每组3个重复。预饲1周。期间严格温度控制：最初两天温度维持在35 ℃，之后在1周内逐渐降到21 ℃，并一直维持该温度至试验结束。在试验开始1周内保持湿度55%，1周后降至45%直至实验结束。每天光照23 h，黑暗1 h。饲喂滁州正大的商品雏鸡料（代谢能：13.39 MJ/kg，粗蛋白23.0 %）。试验期间自由采食和饮水。预饲期结束后，从8日龄开始，试验组每天胸肌肌肉注射甲泼尼龙(20mg/kg/d)，对照组肉鸡注射等量无菌生理盐水，连续注射7 d。
2 试验方法
2．1 样品的采集
试验鸡42日龄时，将每羽肉鸡进行编号、称重。将肉鸡仰卧位保定，剪开腹股沟处皮肤，按压膝关节部位，使股骨头从髋臼中暴露出来，根据股骨头形态进行FHN评分[46]。FHN评分标准见表1。将两侧胫骨、股骨、肱骨取下分别装入自封袋中，20 ℃保存，用于测定骨指数、骨密度、生物力学等指标。用手术刀沿矢状面将股骨头切开，一半样品放入冻存管中，70 ℃保存，用于测定相关基因表达量；另一半浸入4 ℃预冷的4 %多聚甲醛中，在4 ℃环境下浸泡48 h，用于组织学检查。
表1 FHN评分标准
Table 1 The standard for evaluation of FHN score
FHN评分
临床解剖表现
0
股骨头有白色关节软骨覆盖，没有任何损伤
1
股骨头上软骨缺失，部分生长板和软骨一起保留在髋臼内，干骺端有局部组织损伤
2
干骺端大面积损坏，发生骨坏死，甚至存在骨折
2．2 骨生长发育指标的测定
2．2．1 骨放射密度的检测 将肱骨、股骨、胫骨样本与16级铝阶（英国Roslin研究所馈赠）置于同一暗盒上，进行拍片。肱骨、股骨、胫骨采用前后位拍摄。摄片条件：焦点胶片距（FFD）80 cm, 球管电压44 kV，3.88 mAs。CR系统扫描获取图像。用NIH Image J 1.32j图像处理系统分析扫描图像。骨骼样本的放射密度用毫米铝阶厚度（mmAl）表示。
2．2．2 骨强度的检测 用三点弯曲试验检测骨强度。在骨骼样本的中点处标记，用游标卡尺测量每根骨样本此处的直径。根据骨骼样本长度确定跨距。骨强度测定仪测定骨骼强度。预载荷速度设为3mm/min，骨骼断裂时停止。通过NEXYGEN PLUS软件（Lloyd Instruments）分析曲线的最高点即为骨强度（用N表示）。
2．3 实时荧光定量PCR测定相关基因mRNA相对表达量
2．3．1 RNA提取前准备 RNAse free water：将1 mL DEPC与1.0 L 去离子水充分混匀，37 ℃摇床避光过夜。次日取出高压，分装。用品RNAse free处理：将1 mL DEPC与1.0 L 去离子水充分混匀，37 ℃摇床避光过夜。次日将吸头台、枪头、镊子、离心管等均小心一个一个放入水中，保证没有气泡，37 ℃摇床避光过夜。次日高压，将浸泡物品取出，烘干备用。
2．3．2 RNA提取步骤 ①将70 ℃保存的股骨头组织取出约100 mg；②将其移入2 mL EP管中，并加入1 mL Trizol，用手术剪将其尽量剪碎，后用手动匀浆仪在冰上将组织匀浆至透明均质溶液，室温静置5 min，使细胞充分裂解；③12,000 g，4 ℃离心5 min；④将上清移入新离心管中，按1：5体积（氯仿：Trizol，V/V）加入200 μL氯仿；⑤剧烈震荡1 min，室温静置5 min，使蛋白和核酸充分分离后，12,000 g，4 ℃离心15 min；⑥将上层水相转入新的1.5 mL EP管中，加入等体积预冷异丙醇，混匀后室温放置10 ~ 15 min，12,000 g，4 ℃离心10 min；⑦弃上清之后，加入1 mL现配75 %的预冷乙醇溶液，混匀；7,500 g，4 ℃离心5 min，弃上清，重复此步骤2 ~ 3次；⑧弃上清之后，沉淀置超净台干燥约10 min，加入10 ~ 20 μL DEPC水完全溶解；⑨用核酸蛋白检测仪测定总RNA浓度和纯度，使A260/A280需要保持在1.8 ~ 2.0。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/dwyx/632.html
