h9n2亚型禽流感病毒样颗粒的构建h9n2亚型禽流感病毒样颗粒的构建(附件)【字数：6391】
1H9N2亚型禽流感是一种重要的禽类传染病，在我国家禽中广泛存在，给我国养禽行业造成了巨大的经济损失。重组病毒样颗粒疫苗是一种有前景的免疫防御方法，它没有核酸，能诱导动物机体产生有效的免疫保护。本实验通过构建pFastBacDual-HA-NA重组载体，将重组载体转化大肠杆菌DH10Bac得到阳性杆粒。将阳性杆粒转染Sf9昆虫细胞进行培养，通过收集上清细胞得到重组的病毒上清，经Western-bolt、血凝试验、神经氨酸酶试验进行重组蛋白表达的鉴定，最后通过电镜观察得到病毒样颗粒。 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
目 录
Abstract1
Key words1
引言1
1□材料与方法2
1.1□材料 2
1.1.1□质粒、菌株及细胞2
1.1.2□毒株2
1.1.3□主要试剂2
1.1.4□仪器与设备 2
1.2□方法 3
1.2.1□引物设计及合成3
1.2.2□HA和NA基因的扩增及克隆4
1.2.3□重组杆状病毒穿梭质粒的构建4
1.2.4□重组杆状病毒的包装4
1.2.5□HA和NA蛋白在Sf9细胞中表达的检测4
2□结果与分析5
2.1□pFastBacDualHANA的构建及鉴定5
2.2□重组杆状病毒的构建与鉴定5
2.3□重组杆状病的拯救6
2.4□病毒样颗粒的纯化及颗粒形态的观察6
2.5□重组蛋白表达的鉴定7
2.5.1□Western blot7
2.5.2□血凝试验7
2.5.3□神经氨酸酶试验8
3□讨论8
致谢9
参考文献10
H9N2亚型禽流感病毒样颗粒的构建
动物医学专业学生 刘煜尧
指导教师 宋素泉
Construction of H9N2 subtype avian influenza viruslike particles
Student majoring in veterinary medicine Liu Yuyao
Tutor Song Suquan
Abstract：H9N2 subtype avian influenza is an important avian infectious disease, because of its wild spread in Poultry, it has caused huge economic losses to the aquaculture industry in China. At present, VLPs is a promising recombinant vaccine. It has no nucleic acid and can induce protective immune response. In this experiment, we construct a recombinant vector pFastBacDualHANA, then transform it into Escherichia coli DH10Bac positive bacmids. The positive rods were transfected into Sf9 insect cells and then the recombinant virus was obtained by collecting supernatant cells. The expression of recombinant protein was evaluated by Westernbolt, hemagglutination test and neuraminidase test. Finally, viruslike particles were observed by electron microscopy.
Key words: avian influenza；H9N2；viruslike particles
接种疫苗目前为止是预防禽流感发生与传播最有效的手段之一，市场上各类禽流感疫苗琳琅满目，为我国禽类养殖业的发展提供了保障。目前市场上使用的H9N2亚型禽流感疫苗均为灭活疫苗，我国有多个厂家生产的10多株H9N2亚型禽流感系列灭活苗[1]，使用的疫苗株皆为2001年前分离获得的。近年来，我国H9N2亚型的禽流感病毒分离株的抗原性一直都在发生变化，疫苗毒株升级迫在眉睫。研究发现，从1998年2006年间来看，毒株抗原性无变化，疫苗的保护率为100%[2]。而对2009－2010年禽流感的流行病学研究中发现[3]，H9抗体较高的免疫鸡依然携带H9N2亚型AIV。表明现有的H9N2亚型AIV灭活疫苗接种鸡进行免疫之后，尽管能使鸡产生较高水平的抗体浓度，但已经不能有效地保护免受当前H9N2亚型AIV流行株的攻击。因此，商品化H9N2亚型AIV灭活疫苗的制备已经具有一定的必要性。
病毒样颗粒(Viruslike particle, VLP)疫苗以其安全性和抗病毒的有效性，成为近些年来研究热点。目前，在人医学上已经有乙型肝炎病毒和人类乳头瘤病毒VLP疫苗上市生产，并获得了巨大的经济收益。VLP的基本结构中不含有病毒核酸，不能在宿主体内自主复制，因而其非常安全。VLP在形态上与病毒粒子相同或相似，可以作为颗粒性抗原可提呈给T、B淋巴细胞，引起机体的免疫反应的产生，且具有广泛的交叉免疫作用，而后者是应对当前流感病毒抗原变异快速的关键。呼吸道黏膜不仅是流感病毒的感染部位，也是宿主防御病毒感染的部位，因而黏膜免疫是流感病毒疫苗研究中急需解决的问题。现有的传统流感病毒灭活疫苗是无法激发黏膜免疫。而VLP流感疫苗可通过鼻内吸入，直接接触粘膜更加容易引起黏膜免疫，因而其应用前景十分广阔。目前为止，国外学者利用杆状表达系统平台，已经成功制备了H1N1、H3N2、H5N1、H5N3、H7N1、H7N9、H9N2等病毒样颗粒疫苗[4,5,6]。此外，在影响流感病毒样颗粒形成的关键成分研究上，Chen等和张树梅等的研究结果皆表明[7,8]，仅HA和NA两个蛋白，即可完成流感VLP的合成和出芽，进一步地奠定了流感病毒VLP疫苗研究的理论基础。与传统鸡胚培养的方式相比，VLP疫苗还具有反应快速的卓越性。目前广泛采用的鸡胚生产疫苗的技术，至少耗时67个月的时间，同时鸡胚的数量也十分受限，对于目前禽流感发生的流行或大流行所需疫苗来说产能十分有限；产生大量的废物，这些废物的处理不仅需要消耗大量的能源，而且也容易造成环境污染。VLP疫苗技术没有鸡胚疫苗生产的缺点，且不用分离病毒，只需知道病毒的序列，即可作出快速反应。比如，在H7N9禽流感疫情发生后一个月左右，美国Medicago公司即宣布研发出H7N9禽流感VLP疫苗。这种在疫情面前高效的疫苗制备技术，对于可能产生巨大经济损失的家禽养殖业具有重要的意义。
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Abstract1
Key words1
引言1
1□材料与方法2
1.1□材料 2
1.1.1□质粒、菌株及细胞2
1.1.2□毒株2
1.1.3□主要试剂2
1.1.4□仪器与设备 2
1.2□方法 3
1.2.1□引物设计及合成3
1.2.2□HA和NA基因的扩增及克隆4
1.2.3□重组杆状病毒穿梭质粒的构建4
1.2.4□重组杆状病毒的包装4
1.2.5□HA和NA蛋白在Sf9细胞中表达的检测4
2□结果与分析5
2.1□pFastBacDualHANA的构建及鉴定5
2.2□重组杆状病毒的构建与鉴定5
2.3□重组杆状病的拯救6
2.4□病毒样颗粒的纯化及颗粒形态的观察6
2.5□重组蛋白表达的鉴定7
2.5.1□Western blot7
2.5.2□血凝试验7
2.5.3□神经氨酸酶试验8
3□讨论8
致谢9
参考文献10
H9N2亚型禽流感病毒样颗粒的构建
动物医学专业学生 刘煜尧
指导教师 宋素泉
Construction of H9N2 subtype avian influenza viruslike particles
Student majoring in veterinary medicine Liu Yuyao
Tutor Song Suquan
Abstract：H9N2 subtype avian influenza is an important avian infectious disease, because of its wild spread in Poultry, it has caused huge economic losses to the aquaculture industry in China. At present, VLPs is a promising recombinant vaccine. It has no nucleic acid and can induce protective immune response. In this experiment, we construct a recombinant vector pFastBacDualHANA, then transform it into Escherichia coli DH10Bac positive bacmids. The positive rods were transfected into Sf9 insect cells and then the recombinant virus was obtained by collecting supernatant cells. The expression of recombinant protein was evaluated by Westernbolt, hemagglutination test and neuraminidase test. Finally, viruslike particles were observed by electron microscopy.
Key words: avian influenza；H9N2；viruslike particles
接种疫苗目前为止是预防禽流感发生与传播最有效的手段之一，市场上各类禽流感疫苗琳琅满目，为我国禽类养殖业的发展提供了保障。目前市场上使用的H9N2亚型禽流感疫苗均为灭活疫苗，我国有多个厂家生产的10多株H9N2亚型禽流感系列灭活苗[1]，使用的疫苗株皆为2001年前分离获得的。近年来，我国H9N2亚型的禽流感病毒分离株的抗原性一直都在发生变化，疫苗毒株升级迫在眉睫。研究发现，从1998年2006年间来看，毒株抗原性无变化，疫苗的保护率为100%[2]。而对2009－2010年禽流感的流行病学研究中发现[3]，H9抗体较高的免疫鸡依然携带H9N2亚型AIV。表明现有的H9N2亚型AIV灭活疫苗接种鸡进行免疫之后，尽管能使鸡产生较高水平的抗体浓度，但已经不能有效地保护免受当前H9N2亚型AIV流行株的攻击。因此，商品化H9N2亚型AIV灭活疫苗的制备已经具有一定的必要性。
病毒样颗粒(Viruslike particle, VLP)疫苗以其安全性和抗病毒的有效性，成为近些年来研究热点。目前，在人医学上已经有乙型肝炎病毒和人类乳头瘤病毒VLP疫苗上市生产，并获得了巨大的经济收益。VLP的基本结构中不含有病毒核酸，不能在宿主体内自主复制，因而其非常安全。VLP在形态上与病毒粒子相同或相似，可以作为颗粒性抗原可提呈给T、B淋巴细胞，引起机体的免疫反应的产生，且具有广泛的交叉免疫作用，而后者是应对当前流感病毒抗原变异快速的关键。呼吸道黏膜不仅是流感病毒的感染部位，也是宿主防御病毒感染的部位，因而黏膜免疫是流感病毒疫苗研究中急需解决的问题。现有的传统流感病毒灭活疫苗是无法激发黏膜免疫。而VLP流感疫苗可通过鼻内吸入，直接接触粘膜更加容易引起黏膜免疫，因而其应用前景十分广阔。目前为止，国外学者利用杆状表达系统平台，已经成功制备了H1N1、H3N2、H5N1、H5N3、H7N1、H7N9、H9N2等病毒样颗粒疫苗[4,5,6]。此外，在影响流感病毒样颗粒形成的关键成分研究上，Chen等和张树梅等的研究结果皆表明[7,8]，仅HA和NA两个蛋白，即可完成流感VLP的合成和出芽，进一步地奠定了流感病毒VLP疫苗研究的理论基础。与传统鸡胚培养的方式相比，VLP疫苗还具有反应快速的卓越性。目前广泛采用的鸡胚生产疫苗的技术，至少耗时67个月的时间，同时鸡胚的数量也十分受限，对于目前禽流感发生的流行或大流行所需疫苗来说产能十分有限；产生大量的废物，这些废物的处理不仅需要消耗大量的能源，而且也容易造成环境污染。VLP疫苗技术没有鸡胚疫苗生产的缺点，且不用分离病毒，只需知道病毒的序列，即可作出快速反应。比如，在H7N9禽流感疫情发生后一个月左右，美国Medicago公司即宣布研发出H7N9禽流感VLP疫苗。这种在疫情面前高效的疫苗制备技术，对于可能产生巨大经济损失的家禽养殖业具有重要的意义。
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