迷迭香酸对高温诱导的成肌细胞的增殖和凋亡的保护作用
迷迭香酸对高温诱导的成肌细胞的增殖和凋亡的保护作用[20200510204429]
摘要：高温将引起动物的组织或者细胞的损伤。迷迭香酸（RA）作为一种良好的抗氧化剂和保健产品，对高温引起的骨骼肌细胞损伤的作用及其机制目前仍然是不知道的。本试验主要探索RA对高温诱导的C2C12骨骼肌细胞的凋亡和损伤的作用。C2C12细胞被培养在含不同浓度的(0, 25, 50, 100µM)RA中，用42℃的高温诱导细胞的凋亡和损伤，然后分析不同剂量的RA对细胞凋亡和损伤的的影响。MTT结果表明，RA对热应激诱导的细胞损伤有保护作用，其中50µM RA组具有更高的细胞活性。在42℃含50µM RA条件下，Hochest33342/PI双染结果表明C2C12细胞凋亡的数量与对照组相比明显降低；MDA的形成明显降低；SOD的活性被明显升高；同时Caspase-3的活性及Bax/Bcl-2的mRNA水平明显下调。总之，这些结果至少表明RA通过改变凋亡相关基因的表达和增加细胞内抗氧化能力对高温诱导C2C12成肌细胞的凋亡和损伤提供保护作用。
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关键字:热应激；迷迭香酸；C2C12成肌细胞；凋亡和损伤
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法2
1.1 细胞培养和高温处理2
1.2 细胞活性的检测3
1.3 凋亡的检测3
1.4 Caspase-3 活性检测3
1.5 MDA和SOD活性测定3
1.6 Caspase-3的表达量测定4
1.7 数据分析4
2 结果4
2.1 RA对高温诱导成肌细胞损伤的保护作用4
2.2 RA降低高温对C2C12成肌细胞凋亡的作用5
2.3 RA降低高温引起的细胞的氧化损伤6
2.4 RA对应激相关基因的表达的影响7 3 结果讨论8
致谢8
参考文献9
迷迭香酸对高温诱导的成肌细胞的增殖和凋亡的保护作用
引言
细胞凋亡(apoptosis)是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡, 最早是 1972年由 Kerr教授根据形态学特征首先提出的。细胞凋亡是一个主动的、信号依赖的过程, 可以由许多因素所诱导, 如放射线照射、毒素、药物、缺血、缺氧、病毒感染等。凋亡可以引起细胞一系列生化反应导致细胞形态学改变包括膜空泡，细胞皱缩，细胞核断裂等[]。在骨骼肌细胞中，凋亡在正常和非正常的细胞中都可发生，将影响肌管的融合和肌分化[,]。我们知道Caspase半胱氨酸蛋白酶家族作为细胞凋亡过程中的中心环节和执行者近年来被广泛关注，其中Caspase-3被最广泛的研究，认为caspase-3 是凋亡信号通路中的关键效应酶[]。
MDA 是体内多价不饱和脂肪酸脂质过氧 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
化后的降解产物，作为交联剂促使蛋白质、核酸、磷脂等生命大分子的交联聚合，改变生物大分子的功能，具有细胞毒性，其含量在一定程度上反映体内自由基多少及机体细胞受自由基损伤的程度[]。SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧离子自由基使他们变成无毒的水和氧气，保护细胞免受损伤，是人体防御内外环境中超氧离子损伤的重要酶[]。
另外，许多蛋白参与细胞凋亡的调控，如Bcl-2家族，包括Bcl-2和Bax表达[]。Bcl-2是一种抑制凋亡原癌基因，它主要位于线粒体外膜、核被膜和内质网。Bax与Bcl-2有较高的同源性，其表达水平增加可拮抗Bcl-2的作用，是一种诱导凋亡原癌基因，两者间相互作用调控细胞凋亡。研究显示，Bcl-2/Bax比值上调，抑制细胞凋亡；Bcl-2/Bax比值下调，促进细胞凋亡。同时,相关报道表明在许多细胞类型中，Bcl-2的过度表达起到抑制细胞程序性死亡的作用[]。
迷迭香酸( Rosemarinic acid) 是一种含多酚羟基的酸,分子式为C18H16O8 化学名称为R(t)2-[[3 -( 3, 4-二羟基苯基)-1-氧代-2-丙烯基]氧基]-3,4-二羟基苯丙酸, 1958 年 Ellis首次从迷迭香植物(Rosmarinius officinalis) 中分离提取而得名。迷迭香酸分布广泛,从低等苔藓到高等双子叶植物都有报道,主要分布于唇形科、紫草科、葫芦科、椴树科、伞形科中[,]。目前, 对迷迭香酸的研究主要集中在抗炎、抗病毒、抑制肿瘤等方面[-], 而对其骨骼肌的作用尤其是对热应激诱导的急性化学性骨骼肌细胞损伤的研究却相对较少。本实验的主要目的是研究迷迭香酸对热应激诱导的骨骼肌细胞的增殖和凋亡的作用及其机理。
1 材料与方法
1.1细胞的培养和高温处理
C2C12成肌细胞系由大学石磊赠送。C2C12成肌细胞用生长培养基培养（DMEM/F12+10%胎牛血清+1%双抗），于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，培养基两天更换一次，当细胞生长到80%时更换含不同浓度(0, 25, 50, 100µM)RA的培养基，预处理1小时后置于42℃水浴锅中热处理1小时，然后放回37℃恒温培养箱中恢复12小时，进行细胞活性测定，最终选择50µM RA进行下一步实验。
1.2细胞活性的检测
MTT比色法检测细胞活性，将细胞细胞等密度接种于96孔细胞培养板中，每个处理设8个重复，待其到对数生长期，给予以上处理后进行MTT比色法检测，具体步骤为：
每孔加入50ulMTT溶液，继续培养4h。然后每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。同时设置调零孔（MTT、二甲基亚砜）。
1.3凋亡的检测
RA对高温诱导的C2C12 细胞凋亡的影响: 采用 Hoechst33342/PI双染检测 C2C12 细胞凋亡。Hoechst33342/PI双染中, PI及 Hoechst33342 均可与细胞核 DNA( 或 RNA) 特异性结合, 在紫外光激发下分别发出蓝色光和红色光。Hoechst 为膜通透性的荧光染料, 但是 PI不能通过正常的细胞膜 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
, 正常细胞和中早期凋亡细胞均可被 Hoechst 着色。正常细胞核的Hoechst 着色的形态呈圆形, 淡蓝色, 内有较深的蓝色颗粒; 中早期凋亡细胞的核由于浓集, Hoechst 着色呈亮蓝色, 或核呈分叶, 碎片状, 边集; 坏死或晚期凋亡的细胞, 细胞膜被破坏, 这时 PI 着红色, Hoechst 因细胞膜破裂而不能着色。取处理好的C2C12 细胞, 用浓度为0.25%的胰酶消化, 制备单细胞悬液,立即进行 Hoechst33342/ PI凋亡双染。用预冷的无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.4)漂洗 3 次, 重新加入新鲜培养液, 置于 37 ℃培养箱中与Hoechst 33342 染液(终浓度 10 mg/L)共孵育15 min。预冷磷酸盐缓冲液漂洗 1次, 加入终浓度 50 mg/L 的 PI 染液室温孵育 5 min, 预冷磷酸盐缓冲液漂洗 1次, 荧光倒置显微镜下观察并照相。
1.4 Caspase-3 活性检测
Caspase-3酶活性用Caspase-3凋亡检测试剂盒检测，该试剂盒购于（南京建成生物研究所）。具体步骤为：胰酶消化贴壁细胞，并收集细胞，用PBS洗涤一次，吸尽上清后，按照每200万细胞加入50微升裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解30min，其间涡旋振荡3～4次,每次10s，4℃离心(12,000rpm,10～15min）。小心吸取上清（含裂解的蛋白质）转移至新的管中，并放置冰上待用。立即测定caspase-3的酶活性或-70℃保存样品。
Caspase 3酶活性的检测：
a.取出适量的Ac-DEVD-pNA 和2×反应液，置于冰浴上备用。
为了进一步检测RA对热应激细胞的损伤，我们检测一些氧化损伤相关指标。我们检测处理后细胞培养基中MDA和SOD水平。如图3在热应激组（42℃）细胞丙二醛（MDA）含量与正常对照组（37℃）明显升高。同时，热应激组含RA组明显低于其热应激对照组（P <0.05）。而SOD 的活性的趋势与以上两者恰恰相反，如图4在热应激组（42℃）SOD活性明显低于正常对照组，并且热应激对照组是最低的（P <0.05）。因此，我们的结果表明RA可以降低高温对C2C12成肌细胞引起的氧化损伤。
摘要：高温将引起动物的组织或者细胞的损伤。迷迭香酸（RA）作为一种良好的抗氧化剂和保健产品，对高温引起的骨骼肌细胞损伤的作用及其机制目前仍然是不知道的。本试验主要探索RA对高温诱导的C2C12骨骼肌细胞的凋亡和损伤的作用。C2C12细胞被培养在含不同浓度的(0, 25, 50, 100µM)RA中，用42℃的高温诱导细胞的凋亡和损伤，然后分析不同剂量的RA对细胞凋亡和损伤的的影响。MTT结果表明，RA对热应激诱导的细胞损伤有保护作用，其中50µM RA组具有更高的细胞活性。在42℃含50µM RA条件下，Hochest33342/PI双染结果表明C2C12细胞凋亡的数量与对照组相比明显降低；MDA的形成明显降低；SOD的活性被明显升高；同时Caspase-3的活性及Bax/Bcl-2的mRNA水平明显下调。总之，这些结果至少表明RA通过改变凋亡相关基因的表达和增加细胞内抗氧化能力对高温诱导C2C12成肌细胞的凋亡和损伤提供保护作用。
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关键字:热应激；迷迭香酸；C2C12成肌细胞；凋亡和损伤
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法2
1.1 细胞培养和高温处理2
1.2 细胞活性的检测3
1.3 凋亡的检测3
1.4 Caspase-3 活性检测3
1.5 MDA和SOD活性测定3
1.6 Caspase-3的表达量测定4
1.7 数据分析4
2 结果4
2.1 RA对高温诱导成肌细胞损伤的保护作用4
2.2 RA降低高温对C2C12成肌细胞凋亡的作用5
2.3 RA降低高温引起的细胞的氧化损伤6
2.4 RA对应激相关基因的表达的影响7 3 结果讨论8
致谢8
参考文献9
迷迭香酸对高温诱导的成肌细胞的增殖和凋亡的保护作用
引言
细胞凋亡(apoptosis)是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡, 最早是 1972年由 Kerr教授根据形态学特征首先提出的。细胞凋亡是一个主动的、信号依赖的过程, 可以由许多因素所诱导, 如放射线照射、毒素、药物、缺血、缺氧、病毒感染等。凋亡可以引起细胞一系列生化反应导致细胞形态学改变包括膜空泡，细胞皱缩，细胞核断裂等[]。在骨骼肌细胞中，凋亡在正常和非正常的细胞中都可发生，将影响肌管的融合和肌分化[,]。我们知道Caspase半胱氨酸蛋白酶家族作为细胞凋亡过程中的中心环节和执行者近年来被广泛关注，其中Caspase-3被最广泛的研究，认为caspase-3 是凋亡信号通路中的关键效应酶[]。
MDA 是体内多价不饱和脂肪酸脂质过氧 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
化后的降解产物，作为交联剂促使蛋白质、核酸、磷脂等生命大分子的交联聚合，改变生物大分子的功能，具有细胞毒性，其含量在一定程度上反映体内自由基多少及机体细胞受自由基损伤的程度[]。SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧离子自由基使他们变成无毒的水和氧气，保护细胞免受损伤，是人体防御内外环境中超氧离子损伤的重要酶[]。
另外，许多蛋白参与细胞凋亡的调控，如Bcl-2家族，包括Bcl-2和Bax表达[]。Bcl-2是一种抑制凋亡原癌基因，它主要位于线粒体外膜、核被膜和内质网。Bax与Bcl-2有较高的同源性，其表达水平增加可拮抗Bcl-2的作用，是一种诱导凋亡原癌基因，两者间相互作用调控细胞凋亡。研究显示，Bcl-2/Bax比值上调，抑制细胞凋亡；Bcl-2/Bax比值下调，促进细胞凋亡。同时,相关报道表明在许多细胞类型中，Bcl-2的过度表达起到抑制细胞程序性死亡的作用[]。
迷迭香酸( Rosemarinic acid) 是一种含多酚羟基的酸,分子式为C18H16O8 化学名称为R(t)2-[[3 -( 3, 4-二羟基苯基)-1-氧代-2-丙烯基]氧基]-3,4-二羟基苯丙酸, 1958 年 Ellis首次从迷迭香植物(Rosmarinius officinalis) 中分离提取而得名。迷迭香酸分布广泛,从低等苔藓到高等双子叶植物都有报道,主要分布于唇形科、紫草科、葫芦科、椴树科、伞形科中[,]。目前, 对迷迭香酸的研究主要集中在抗炎、抗病毒、抑制肿瘤等方面[-], 而对其骨骼肌的作用尤其是对热应激诱导的急性化学性骨骼肌细胞损伤的研究却相对较少。本实验的主要目的是研究迷迭香酸对热应激诱导的骨骼肌细胞的增殖和凋亡的作用及其机理。
1 材料与方法
1.1细胞的培养和高温处理
C2C12成肌细胞系由大学石磊赠送。C2C12成肌细胞用生长培养基培养（DMEM/F12+10%胎牛血清+1%双抗），于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，培养基两天更换一次，当细胞生长到80%时更换含不同浓度(0, 25, 50, 100µM)RA的培养基，预处理1小时后置于42℃水浴锅中热处理1小时，然后放回37℃恒温培养箱中恢复12小时，进行细胞活性测定，最终选择50µM RA进行下一步实验。
1.2细胞活性的检测
MTT比色法检测细胞活性，将细胞细胞等密度接种于96孔细胞培养板中，每个处理设8个重复，待其到对数生长期，给予以上处理后进行MTT比色法检测，具体步骤为：
每孔加入50ulMTT溶液，继续培养4h。然后每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。同时设置调零孔（MTT、二甲基亚砜）。
1.3凋亡的检测
RA对高温诱导的C2C12 细胞凋亡的影响: 采用 Hoechst33342/PI双染检测 C2C12 细胞凋亡。Hoechst33342/PI双染中, PI及 Hoechst33342 均可与细胞核 DNA( 或 RNA) 特异性结合, 在紫外光激发下分别发出蓝色光和红色光。Hoechst 为膜通透性的荧光染料, 但是 PI不能通过正常的细胞膜 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
, 正常细胞和中早期凋亡细胞均可被 Hoechst 着色。正常细胞核的Hoechst 着色的形态呈圆形, 淡蓝色, 内有较深的蓝色颗粒; 中早期凋亡细胞的核由于浓集, Hoechst 着色呈亮蓝色, 或核呈分叶, 碎片状, 边集; 坏死或晚期凋亡的细胞, 细胞膜被破坏, 这时 PI 着红色, Hoechst 因细胞膜破裂而不能着色。取处理好的C2C12 细胞, 用浓度为0.25%的胰酶消化, 制备单细胞悬液,立即进行 Hoechst33342/ PI凋亡双染。用预冷的无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.4)漂洗 3 次, 重新加入新鲜培养液, 置于 37 ℃培养箱中与Hoechst 33342 染液(终浓度 10 mg/L)共孵育15 min。预冷磷酸盐缓冲液漂洗 1次, 加入终浓度 50 mg/L 的 PI 染液室温孵育 5 min, 预冷磷酸盐缓冲液漂洗 1次, 荧光倒置显微镜下观察并照相。
1.4 Caspase-3 活性检测
Caspase-3酶活性用Caspase-3凋亡检测试剂盒检测，该试剂盒购于（南京建成生物研究所）。具体步骤为：胰酶消化贴壁细胞，并收集细胞，用PBS洗涤一次，吸尽上清后，按照每200万细胞加入50微升裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解30min，其间涡旋振荡3～4次,每次10s，4℃离心(12,000rpm,10～15min）。小心吸取上清（含裂解的蛋白质）转移至新的管中，并放置冰上待用。立即测定caspase-3的酶活性或-70℃保存样品。
Caspase 3酶活性的检测：
a.取出适量的Ac-DEVD-pNA 和2×反应液，置于冰浴上备用。
为了进一步检测RA对热应激细胞的损伤，我们检测一些氧化损伤相关指标。我们检测处理后细胞培养基中MDA和SOD水平。如图3在热应激组（42℃）细胞丙二醛（MDA）含量与正常对照组（37℃）明显升高。同时，热应激组含RA组明显低于其热应激对照组（P <0.05）。而SOD 的活性的趋势与以上两者恰恰相反，如图4在热应激组（42℃）SOD活性明显低于正常对照组，并且热应激对照组是最低的（P <0.05）。因此，我们的结果表明RA可以降低高温对C2C12成肌细胞引起的氧化损伤。
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