HDAC9在HCV感染导致Huh7乙酰水平下降机制的初步探索
HDAC9在HCV感染导致Huh7乙酰水平下降机制的初步探索[20200507184425]
摘要：丙型肝炎病毒（HCV）感染肝癌细胞Huh7可导致总蛋白乙酰化水平下降，同时基因芯片结果显示：HCV感染可刺激Huh7中组蛋白去乙酰化酶9（HDAC9）mRNA表达水平上调，因此我们关注了HDAC9在HCV感染过程中与乙酰化的关系。本实验首先证实了HDAC9在HCV感染的Huh7中mRNA表达上调这一现象，而HDACs抑制剂（TSA）可减弱HCV对过氧化物酶体增殖物激活受体α和视网膜母细胞瘤抑制蛋白的作用。另外仙台病毒（SeV）感染人肺上皮细胞A549同样能够上调HDAC9 mRNA，通过使用pGL-3-basic质粒构建含有HDAC9启动子序列的载体，利用双荧光报告系统，可以在A549中SeV激活HDAC9的启动子，因此推测病毒可能通过启动子元件激活HDAC9的转录调控。
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关键字:丙型肝炎病毒；蛋白质乙酰化；组蛋白去乙酰化酶9
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
1 材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1 菌株、质粒、细胞、病毒 3
1.1.2 实验试剂 3
1.1.3 仪器和设备 3
1.2 方法 3
1.2.1 HCV感染肝癌细胞Huh7后细胞组蛋白乙酰化水平变化的观察 3
1.2.2 HCV感染肝癌细胞Huh7后过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）和视网膜母细胞瘤抑制因子（Rb tumor suppressor）mRNA水平变化的观察 4
1.2.3 外源刺激因子诱导不同细胞系中HDAC9 mRNA水平变化的观察 4
1.2.4 HDAC9启动子重组质粒的构建、细胞转染及活性的检测 4
1.2.5 HDAC9转录本G的克隆、过表达和HDAC9 G蛋白的免疫荧光染色 4
2.1 HCV感染导致组蛋白乙酰化水平下降 5
2.2 HCV抑制Huh7中PPARα和Rb表达，而TSA减弱HCV的抑制作用 5
2.3 HCV 和SeV可诱导多种细胞系中HDAC9的上调 5
2.4 HDAC9启动子重组质粒的构建及活性检测 5
2.5 HDAC9转录本的克隆和G蛋白的免疫荧光染色 6
3 讨论 6
致谢 7
参考文献： 7
图 1 pGL3 Basic质粒 8
图 2 pLVX-IRES-zsGreen1质粒图谱 9
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图 3 HCV感染减弱Huh7组蛋白乙酰化水平 10
图 4 HCV和TSA对PPARα和Rb mRNA表达的作用 10
图 5-1 HCV诱导Huh7中HDACs的表达情况 11
图 5-2 SeV诱导A549中HDACs的表达情况 11
图 6 HDAC9启动子预测序列凝胶电泳图 11
图 7 SeV刺激Huh7 pGL3 Basic-HDAC9启动子预测序列 12
图 8 HDAC9转录本克隆 12
图 9 HDAC9 G蛋白免疫荧光染色 12
HDAC9在HCV感染导致Huh7乙酰水平下降机制的初步探索
引言
丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）属于黄病毒科丙型肝炎病毒属，是一种有包膜的单股正链RNA病毒；除逆转录病毒外，它是唯一可以通过激活胞内大分子导致肝癌发生的RNA病毒[1]。据报道全球有1700万人感染慢性丙肝，大约占总人口的3%，并且每年多于35万人死于HCV感染。HCV感染初期症状不明显，但因其能以多种策略逃避宿主细胞的天然免疫识别系统，导致高达85%的慢性化率，并出现肝脏炎症、纤维化以及脂质代谢紊乱等症状，最终导致肝硬化、坏死和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）[1-3]。原代肝细胞系HepG2与肝癌细胞系Huh7同源自肝脏，但目前仅Huh7及其同源系常用于HCV RNA复制子扩增[4, 5]。
蛋白质乙酰化这一过程主要由赖氨酸乙酰转移酶（lysine acetyltransferases, KATs）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases, HDACs）调控；赖氨酸乙酰转移酶常作用于组蛋白，故称组蛋白乙酰转移酶（HAT）。作为组蛋白和核内转录调控因子主要的修饰方式之一，乙酰化在染色质动态性以及基因表达中的作用备受重视。有学者指出，乙酰化可能在细胞应对外界不同代谢途径的过程中扮演重要角色，如通过多种途径调节酶代谢（包括激活酶原，抑制酶活影响蛋白质稳定性）[6]。乙酰化主要通过在组蛋白H3和H4的N端赖氨酸残基上引入疏水的乙酰基团(CH3CO)，增加染色质DNA与蛋白质间的静电引力，从而减弱二者间相互作用，使染色质结构疏松利于基因转录的激活；而HDAC的作用则相反，常常导致基因沉默[7, 8] 。
过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator-activated receptor α, PPARα）也叫核受体亚家族1（Nuclear receptor subfamily 1, group C, member 1），与PPARβ、γ共同构成核受体家族成员；PPARα在肝脏中高度表达，主要参与脂质代谢，如作为生酮反应的关键因子，并且通过抑制白介素6和急性反应期炎症蛋白的产生，调节肝脏的免疫反应的[9]。PPARα激活后，可通过进一步上调脂肪酸转运相关基因的表达来促进脂肪酸的吸收，利用和分解[10]。有学者表示HCV核心蛋白core有可能通过与PPARα互作，影响后者的转录活性；而二者间的这种相互作用关系将有利于研究HCV的致病机理[11, 12]。另外HCV并不携带任何原癌基因，但就目前的认识HCV编码的蛋白可能会通过与宿主某些蛋白作用，促进 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
肿瘤发生[1]。视网膜母细胞瘤抑制因子（retinoblastoma, RB tumor suppressor）就是一个例子，在调控细胞增殖和凋亡途径中，Rb肿瘤抑制蛋白通过调节E2F转录因子发挥关键作用；在许多癌症病例中尤其是HCC，Rb肿瘤抑制蛋白常发生突变，导致功能性灭活失效[13, 14]。
前期的工作中（数据尚未发表），通过用组蛋白去乙酰化酶抑制剂trichostatin A（TSA）处理HCV感染的Huh7细胞，检测PPARα和Rb抑制基因的表达水平时，我们发现TSA可以明显减弱HCV对PPARα和Rb肿瘤抑制蛋白基因表达的抑制作用。不仅如此，根据本实验室之前的基因芯片数据显示，在线粒体抗病毒信号蛋白（Mitochondrial Antiviral Signaling Protein, MAVS）也叫VISA，Cardif或者IPS-1的突变体C508R（不能被NS3蛋白切割）过表达的肝癌细胞系Huh7中，组蛋白去乙酰化酶9（HDAC9）的表达水平显著上调，由此我们推测HDAC9可能在HCV感染过程中发挥降低乙酰水平的作用，但究竟HDAC9是通过怎样的形式发挥作用，这引发了我们的思考。为了探究HDAC9是否在其中发挥作用及其作用形式，我们分析了HDAC9在不同细胞系中的表达情况及其启动子序列，同时结合分子生物学手段构建HDAC9启动子序列特异性质粒进行初步探索。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒、细胞、病毒 E.coli DH5α菌株为本实验室保藏；内参照海肾荧光素酶Rellina报告质粒，pGL3-basic和pLVX-IRES-zsGreen1质粒原始克隆为本实验保藏；pEASY-Blunt Cloning Vector购自北京全式金生物技术有限公司；肝癌细胞系Huh7、人肺腺癌上皮细胞系A549和人胚肾细胞293T培养基为DMEM含10%胎牛血清及100U/mL青霉素和100μg/L链霉素，均培养于37℃、5% CO2细胞培养箱；丙型肝炎病毒（HCV）、仙台病毒（SeV）为本实验保藏。
摘要：丙型肝炎病毒（HCV）感染肝癌细胞Huh7可导致总蛋白乙酰化水平下降，同时基因芯片结果显示：HCV感染可刺激Huh7中组蛋白去乙酰化酶9（HDAC9）mRNA表达水平上调，因此我们关注了HDAC9在HCV感染过程中与乙酰化的关系。本实验首先证实了HDAC9在HCV感染的Huh7中mRNA表达上调这一现象，而HDACs抑制剂（TSA）可减弱HCV对过氧化物酶体增殖物激活受体α和视网膜母细胞瘤抑制蛋白的作用。另外仙台病毒（SeV）感染人肺上皮细胞A549同样能够上调HDAC9 mRNA，通过使用pGL-3-basic质粒构建含有HDAC9启动子序列的载体，利用双荧光报告系统，可以在A549中SeV激活HDAC9的启动子，因此推测病毒可能通过启动子元件激活HDAC9的转录调控。
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关键字:丙型肝炎病毒；蛋白质乙酰化；组蛋白去乙酰化酶9
目录
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关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
1 材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1 菌株、质粒、细胞、病毒 3
1.1.2 实验试剂 3
1.1.3 仪器和设备 3
1.2 方法 3
1.2.1 HCV感染肝癌细胞Huh7后细胞组蛋白乙酰化水平变化的观察 3
1.2.2 HCV感染肝癌细胞Huh7后过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）和视网膜母细胞瘤抑制因子（Rb tumor suppressor）mRNA水平变化的观察 4
1.2.3 外源刺激因子诱导不同细胞系中HDAC9 mRNA水平变化的观察 4
1.2.4 HDAC9启动子重组质粒的构建、细胞转染及活性的检测 4
1.2.5 HDAC9转录本G的克隆、过表达和HDAC9 G蛋白的免疫荧光染色 4
2.1 HCV感染导致组蛋白乙酰化水平下降 5
2.2 HCV抑制Huh7中PPARα和Rb表达，而TSA减弱HCV的抑制作用 5
2.3 HCV 和SeV可诱导多种细胞系中HDAC9的上调 5
2.4 HDAC9启动子重组质粒的构建及活性检测 5
2.5 HDAC9转录本的克隆和G蛋白的免疫荧光染色 6
3 讨论 6
致谢 7
参考文献： 7
图 1 pGL3 Basic质粒 8
图 2 pLVX-IRES-zsGreen1质粒图谱 9
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
图 3 HCV感染减弱Huh7组蛋白乙酰化水平 10
图 4 HCV和TSA对PPARα和Rb mRNA表达的作用 10
图 5-1 HCV诱导Huh7中HDACs的表达情况 11
图 5-2 SeV诱导A549中HDACs的表达情况 11
图 6 HDAC9启动子预测序列凝胶电泳图 11
图 7 SeV刺激Huh7 pGL3 Basic-HDAC9启动子预测序列 12
图 8 HDAC9转录本克隆 12
图 9 HDAC9 G蛋白免疫荧光染色 12
HDAC9在HCV感染导致Huh7乙酰水平下降机制的初步探索
引言
丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）属于黄病毒科丙型肝炎病毒属，是一种有包膜的单股正链RNA病毒；除逆转录病毒外，它是唯一可以通过激活胞内大分子导致肝癌发生的RNA病毒[1]。据报道全球有1700万人感染慢性丙肝，大约占总人口的3%，并且每年多于35万人死于HCV感染。HCV感染初期症状不明显，但因其能以多种策略逃避宿主细胞的天然免疫识别系统，导致高达85%的慢性化率，并出现肝脏炎症、纤维化以及脂质代谢紊乱等症状，最终导致肝硬化、坏死和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）[1-3]。原代肝细胞系HepG2与肝癌细胞系Huh7同源自肝脏，但目前仅Huh7及其同源系常用于HCV RNA复制子扩增[4, 5]。
蛋白质乙酰化这一过程主要由赖氨酸乙酰转移酶（lysine acetyltransferases, KATs）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases, HDACs）调控；赖氨酸乙酰转移酶常作用于组蛋白，故称组蛋白乙酰转移酶（HAT）。作为组蛋白和核内转录调控因子主要的修饰方式之一，乙酰化在染色质动态性以及基因表达中的作用备受重视。有学者指出，乙酰化可能在细胞应对外界不同代谢途径的过程中扮演重要角色，如通过多种途径调节酶代谢（包括激活酶原，抑制酶活影响蛋白质稳定性）[6]。乙酰化主要通过在组蛋白H3和H4的N端赖氨酸残基上引入疏水的乙酰基团(CH3CO)，增加染色质DNA与蛋白质间的静电引力，从而减弱二者间相互作用，使染色质结构疏松利于基因转录的激活；而HDAC的作用则相反，常常导致基因沉默[7, 8] 。
过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator-activated receptor α, PPARα）也叫核受体亚家族1（Nuclear receptor subfamily 1, group C, member 1），与PPARβ、γ共同构成核受体家族成员；PPARα在肝脏中高度表达，主要参与脂质代谢，如作为生酮反应的关键因子，并且通过抑制白介素6和急性反应期炎症蛋白的产生，调节肝脏的免疫反应的[9]。PPARα激活后，可通过进一步上调脂肪酸转运相关基因的表达来促进脂肪酸的吸收，利用和分解[10]。有学者表示HCV核心蛋白core有可能通过与PPARα互作，影响后者的转录活性；而二者间的这种相互作用关系将有利于研究HCV的致病机理[11, 12]。另外HCV并不携带任何原癌基因，但就目前的认识HCV编码的蛋白可能会通过与宿主某些蛋白作用，促进 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
肿瘤发生[1]。视网膜母细胞瘤抑制因子（retinoblastoma, RB tumor suppressor）就是一个例子，在调控细胞增殖和凋亡途径中，Rb肿瘤抑制蛋白通过调节E2F转录因子发挥关键作用；在许多癌症病例中尤其是HCC，Rb肿瘤抑制蛋白常发生突变，导致功能性灭活失效[13, 14]。
前期的工作中（数据尚未发表），通过用组蛋白去乙酰化酶抑制剂trichostatin A（TSA）处理HCV感染的Huh7细胞，检测PPARα和Rb抑制基因的表达水平时，我们发现TSA可以明显减弱HCV对PPARα和Rb肿瘤抑制蛋白基因表达的抑制作用。不仅如此，根据本实验室之前的基因芯片数据显示，在线粒体抗病毒信号蛋白（Mitochondrial Antiviral Signaling Protein, MAVS）也叫VISA，Cardif或者IPS-1的突变体C508R（不能被NS3蛋白切割）过表达的肝癌细胞系Huh7中，组蛋白去乙酰化酶9（HDAC9）的表达水平显著上调，由此我们推测HDAC9可能在HCV感染过程中发挥降低乙酰水平的作用，但究竟HDAC9是通过怎样的形式发挥作用，这引发了我们的思考。为了探究HDAC9是否在其中发挥作用及其作用形式，我们分析了HDAC9在不同细胞系中的表达情况及其启动子序列，同时结合分子生物学手段构建HDAC9启动子序列特异性质粒进行初步探索。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒、细胞、病毒 E.coli DH5α菌株为本实验室保藏；内参照海肾荧光素酶Rellina报告质粒，pGL3-basic和pLVX-IRES-zsGreen1质粒原始克隆为本实验保藏；pEASY-Blunt Cloning Vector购自北京全式金生物技术有限公司；肝癌细胞系Huh7、人肺腺癌上皮细胞系A549和人胚肾细胞293T培养基为DMEM含10%胎牛血清及100U/mL青霉素和100μg/L链霉素，均培养于37℃、5% CO2细胞培养箱；丙型肝炎病毒（HCV）、仙台病毒（SeV）为本实验保藏。
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