山羊卵泡发育过程中差异表达基因的分析
在卵泡的选择和发育过程中，涉及到了多种基因表达的调控。为了鉴定山羊卵泡发育过程中基因表达的变化，以24只健康长江三角洲白山羊的小卵泡(1-2 mm)，中卵泡(2-3mm)和大卵泡（5-8mm）为材料，进行RNA测序，分析小卵泡发育至中卵泡再到大卵泡过程中差异表达基因转录组水平变化的特征。基于GO分析和KEGG分析的结果，选择八个与卵泡发育密切相关的基因(FOXL2,Nobox,GDF-9,BMP-15,c-kit,INHBA,CYP19A1,bcl-2)通过趋势分析观察其在卵泡发育过程中基因表达量的变化，进一步验证它们在卵泡发育过程中的作用。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1实验动物4
1.2卵泡采集4
1.3 RNA提取4
1.4 cDNA测序文库的构建及高通量测序4
1.5 差异表达基因功能分类和聚类分析5
1.6 GO和KEGG分析5
1.7趋势分析5
2 结果与分析5
2.1测序基因分析5
2.2转录组数据分析5
2.3差异表达基因的GO分析6
2.4 KEGG通路富集分析差异基因9
2.5基因表达量趋势分析9
3讨论 9
3.1高通量转录组测序 9
3.2转录组数据分析 10
3.3基因本体(Gene ontology，GO)功能显著性富集分析10
3.4 KEGG 通路等显著性富集分析 10
3.5差异基因表达量的变化趋势 10
致谢11
参考文献11
山羊卵泡发育过程中基因差异表达的研究
引言
引言 转录组是特定细胞或组织在某一生理条件下所转录表达的所有RNA总和, 是连接基因组遗传信息与蛋白质组生物功能的桥梁[1,2]。转录组研究作为后基因组时代的重要组学研究和基因功能及结构的基点，不仅是基因表达及调控重要的手段，是发掘功能基因的重要路径[3]。而近年来，随着新一代 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
高通量测序技术的发展，在此基础上产生的转录组测序（RNASeq）技术已渐成为大规模研究转录组的一种新的且更为有效的方法。RNASeq使用高通量测序技术通过RNA逆转录和PCR扩增cDNA来测序[4]。这种技术可以在特定的状态下在单个核苷酸水平上获得特定器官或组织的所有转录本。与其它转录技术相比，RNASeq具有明显的优点，如高通量、低成本、灵敏度高和可获得低丰度表达基因[5]。
长三角白山羊是唯一的山羊、毛皮和羊毛山羊品种。在生殖过程中，生育水平是影响山羊生产的最重要因素之一，同时也是决定利益水平的主要限制因素。而卵子的数量和质量是决定生育水平的重要因素。卵泡发育是一个连续而复杂的过程，由原始卵泡的募集开始，然后发育为初级卵泡和腔前卵泡，再经过有腔卵泡阶段，最后终止于成熟卵泡[6]。因此，保证卵泡正常的生长发育能够提高母羊的繁殖能力，从而进一步提高山羊生产的经济效益。卵泡的生长发育受到多种因素的影响，其中内部基因的调控是最大的影响因子，以下是八个与卵泡发育相关的基因及其调控：
①GDF9(生长分化因子9)是由卵母细胞分泌的生长因子，是转化生长因子β(TGFβ)超家族成员，在调节早期卵泡的生长和分化中起着重要的作用[7]。卵泡发育前期，GDF9可促进卵母细胞发育；在卵泡发育后期，可促进黄体的形成[8]。②Nobox是卵母细胞特异性基因，对原始卵泡的形成有重要作用。有研究表明，通过抑制Notch的活性能够阻止原始卵泡的形成[9]。③CYP19A1基因是产生甾体激素过程中的第一水解酶和限速酶。CYP19A1已证实对于猪正常发挥卵巢的正常功能具有重要作用[10]。④BMP15基因是卵母细胞分泌的一种生长因子，它对动物卵母细胞发育的有明显的调控作用。有研究证明，它的突变会使颗粒细胞早熟和卵泡体积缩小[11]。⑤FOXL2基因主要在卵泡的颗粒细胞中表达。其作用机制可能是通过调节颗粒细胞增殖分化从而促进卵泡的生长发育[12]。⑥ckit基因参与卵泡发育各个阶段的调节。有研究显示，在猪卵泡发育的各阶段都有ckit基因的表达[13]。在山羊卵泡发育的各阶段也发现ckit基因的表达[14]。⑦Bcl2基因参与调节颗粒细胞凋亡。在大鼠颗粒细胞的研究中发现，随着卵巢的生长和发育，颗粒细胞中Bcl2蛋白的表达量有所增加，刚出生的大鼠表达量最低，1月龄大鼠的表达量有所增加，而在成年大鼠颗粒细胞Bcl2蛋白表达水平很高。说明bcl2基因在卵泡发育过程中可能参与调控了颗粒细胞的凋亡[15]。⑧INHBA基因是一种抑制素基因，有研究表明，INHBA主要在母鸡排卵前卵泡的颗粒细胞层内表达[16]。但在山羊卵泡发育的全过程中都有INHBA基因的表达。
1 材料与方法
1．1 实验动物
长江三角洲白山羊，俗称海门山羊，主要分布在长江三角洲地区。它是国内外唯一以生产优质笔料毛为特征的肉、皮、毛兼用山羊品种。具有早熟、繁殖力强、多产、耐温、耐湿、抗粗饲料能力强、适应性强、抗病性强、遗传稳定等特点。现以24只同龄（9个月）的雌性山羊在相同饲养条件总混合日粮（TMRs，60:40粗饲料和浓缩物）饲养作为实验动物，用雄性山羊每天两次发情来确定母羊发情。
1．2 卵泡采集
24只发情山羊在发情后78小时在当地屠宰场屠宰，并立即获得卵巢。在立体显微镜下，用两个镊子将完整的卵巢分离出完整的卵泡。用游标卡尺测量其直径后，立即收集小卵泡(oSF,12 mm)，中卵泡(oMF,23 mm)和大卵泡(oLF,58mm)于卵泡冻存在液氮中，待提取总RNA。
1．3 RNA提取
根据说明书操作步骤，使用RNeasy Micro Kit试剂（Qiagen，德国）提取每个滤泡的总RNA。通过NANODROP评估RNA的产量和纯度。RNA具有1.82.0的260/280吸光度比率用于转录组分析。并使用1%琼脂糖凝胶通过凝胶电泳评估RNA完整性。
1．4 cDNA测序文库的构建及高通量测序
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1实验动物4
1.2卵泡采集4
1.3 RNA提取4
1.4 cDNA测序文库的构建及高通量测序4
1.5 差异表达基因功能分类和聚类分析5
1.6 GO和KEGG分析5
1.7趋势分析5
2 结果与分析5
2.1测序基因分析5
2.2转录组数据分析5
2.3差异表达基因的GO分析6
2.4 KEGG通路富集分析差异基因9
2.5基因表达量趋势分析9
3讨论 9
3.1高通量转录组测序 9
3.2转录组数据分析 10
3.3基因本体(Gene ontology，GO)功能显著性富集分析10
3.4 KEGG 通路等显著性富集分析 10
3.5差异基因表达量的变化趋势 10
致谢11
参考文献11
山羊卵泡发育过程中基因差异表达的研究
引言
引言 转录组是特定细胞或组织在某一生理条件下所转录表达的所有RNA总和, 是连接基因组遗传信息与蛋白质组生物功能的桥梁[1,2]。转录组研究作为后基因组时代的重要组学研究和基因功能及结构的基点，不仅是基因表达及调控重要的手段，是发掘功能基因的重要路径[3]。而近年来，随着新一代 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
高通量测序技术的发展，在此基础上产生的转录组测序（RNASeq）技术已渐成为大规模研究转录组的一种新的且更为有效的方法。RNASeq使用高通量测序技术通过RNA逆转录和PCR扩增cDNA来测序[4]。这种技术可以在特定的状态下在单个核苷酸水平上获得特定器官或组织的所有转录本。与其它转录技术相比，RNASeq具有明显的优点，如高通量、低成本、灵敏度高和可获得低丰度表达基因[5]。
长三角白山羊是唯一的山羊、毛皮和羊毛山羊品种。在生殖过程中，生育水平是影响山羊生产的最重要因素之一，同时也是决定利益水平的主要限制因素。而卵子的数量和质量是决定生育水平的重要因素。卵泡发育是一个连续而复杂的过程，由原始卵泡的募集开始，然后发育为初级卵泡和腔前卵泡，再经过有腔卵泡阶段，最后终止于成熟卵泡[6]。因此，保证卵泡正常的生长发育能够提高母羊的繁殖能力，从而进一步提高山羊生产的经济效益。卵泡的生长发育受到多种因素的影响，其中内部基因的调控是最大的影响因子，以下是八个与卵泡发育相关的基因及其调控：
①GDF9(生长分化因子9)是由卵母细胞分泌的生长因子，是转化生长因子β(TGFβ)超家族成员，在调节早期卵泡的生长和分化中起着重要的作用[7]。卵泡发育前期，GDF9可促进卵母细胞发育；在卵泡发育后期，可促进黄体的形成[8]。②Nobox是卵母细胞特异性基因，对原始卵泡的形成有重要作用。有研究表明，通过抑制Notch的活性能够阻止原始卵泡的形成[9]。③CYP19A1基因是产生甾体激素过程中的第一水解酶和限速酶。CYP19A1已证实对于猪正常发挥卵巢的正常功能具有重要作用[10]。④BMP15基因是卵母细胞分泌的一种生长因子，它对动物卵母细胞发育的有明显的调控作用。有研究证明，它的突变会使颗粒细胞早熟和卵泡体积缩小[11]。⑤FOXL2基因主要在卵泡的颗粒细胞中表达。其作用机制可能是通过调节颗粒细胞增殖分化从而促进卵泡的生长发育[12]。⑥ckit基因参与卵泡发育各个阶段的调节。有研究显示，在猪卵泡发育的各阶段都有ckit基因的表达[13]。在山羊卵泡发育的各阶段也发现ckit基因的表达[14]。⑦Bcl2基因参与调节颗粒细胞凋亡。在大鼠颗粒细胞的研究中发现，随着卵巢的生长和发育，颗粒细胞中Bcl2蛋白的表达量有所增加，刚出生的大鼠表达量最低，1月龄大鼠的表达量有所增加，而在成年大鼠颗粒细胞Bcl2蛋白表达水平很高。说明bcl2基因在卵泡发育过程中可能参与调控了颗粒细胞的凋亡[15]。⑧INHBA基因是一种抑制素基因，有研究表明，INHBA主要在母鸡排卵前卵泡的颗粒细胞层内表达[16]。但在山羊卵泡发育的全过程中都有INHBA基因的表达。
1 材料与方法
1．1 实验动物
长江三角洲白山羊，俗称海门山羊，主要分布在长江三角洲地区。它是国内外唯一以生产优质笔料毛为特征的肉、皮、毛兼用山羊品种。具有早熟、繁殖力强、多产、耐温、耐湿、抗粗饲料能力强、适应性强、抗病性强、遗传稳定等特点。现以24只同龄（9个月）的雌性山羊在相同饲养条件总混合日粮（TMRs，60:40粗饲料和浓缩物）饲养作为实验动物，用雄性山羊每天两次发情来确定母羊发情。
1．2 卵泡采集
24只发情山羊在发情后78小时在当地屠宰场屠宰，并立即获得卵巢。在立体显微镜下，用两个镊子将完整的卵巢分离出完整的卵泡。用游标卡尺测量其直径后，立即收集小卵泡(oSF,12 mm)，中卵泡(oMF,23 mm)和大卵泡(oLF,58mm)于卵泡冻存在液氮中，待提取总RNA。
1．3 RNA提取
根据说明书操作步骤，使用RNeasy Micro Kit试剂（Qiagen，德国）提取每个滤泡的总RNA。通过NANODROP评估RNA的产量和纯度。RNA具有1.82.0的260/280吸光度比率用于转录组分析。并使用1%琼脂糖凝胶通过凝胶电泳评估RNA完整性。
1．4 cDNA测序文库的构建及高通量测序
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