猪norfa基因克隆及snp位点的筛选
实验室前期通过RNA-seq和RACE技术鉴定了一个猪卵巢特异性长链非编码RNA即NORFA，并证实NORFA在调控猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡过程中发挥重要的功能。但猪NORFA基因的序列特征至今还不清楚。因此，本试验拟扩增、克隆梅山猪和大白猪NORFA基因全序列和5’调控区序列，利用生物信息学手段分析其序列特征；通过DNA混池测序技术对梅山猪与大白猪NORFA基因SNP位点进行筛选。结果发现梅山猪和大白猪NORFA基因全长均为1245bp，两者核苷酸序列一致性高达99.92%；梅山猪和大白猪NORFA基因5’调控区序列长度分别为1629bp和1610bp，启动子区含有FoxO1、KLF4等与卵巢颗粒细胞功能相关的转录因子结合位点；DNA混池测序发现在梅山猪NORFA基因及其5’调控区上共有6个SNP位点，而在大白猪NORFA基因上未发现SNP位点。研究结果为进一步解析NORFA基因与母猪繁殖力的关系、NORFA基因的表达调控，筛选猪NORFA基因的有效分子标记，和最终提高母猪繁殖力等提供一定理论依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1试验材料 2
1.2试验方法 3
1.2.1猪基因组DNA提取..3
1.2.2引物设计与合成3
1.2.3PCR扩增及检测4
1.2.4PCR产物的回收与测序4
1.2.5SNP位点的筛选鉴定与多态性分析.............4
2结果与分析....4
2.1猪NORFA基因与5’调控区PCR扩增结果.......................................................5
2.2猪NORFA基因核苷酸序列分...............................................................5
2.3猪NORFA基因5’调控区序列分析..............................................7
2. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
4猪NORFA基因与5’调控区多态位点筛选....................................7
3讨论.10
致谢11
参考文献12
猪NORFA基因克隆及SNP位点的筛选
引言
长链非编码RNA（Long noncoding RNA，LncRNA）是一类长度大于200 nt并且不具备开放阅读框（Open reading frame，ORF）或缺乏蛋白质编码能力的内源性非编码RNA[1,2]。与编码蛋白基因相比，lncRNA的物种间保守性较差并伴随较强的组织特异性与表达时空特异性等特点[3,4]。越来越多的证据表明lncRNAs在表观遗传学调控中扮演着重要角色，在个体生长、发育及病变进程中广泛参与多种细胞生物学过程，比如细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、细胞分化、细胞迁移、侵袭以及癌变等[57]。在人类中，lncRNAs表达和功能异常与多种严重危害健康的重大疾病如退行性神经疾病、心血管疾病，以及白血病、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等肿瘤发生[810]等密切相关。因此，LncRNA正迅速成为继miRNAs之后非编码RNAs研究领域的新热点。
实验室前期在猪卵巢颗粒细胞中鉴定了一个与猪卵泡闭锁相关的新lncRNA即NORFA，并通过RNA末端快速扩增技术（Rapid amplification of cDNA ends，RACE）获得了猪NORFA基因RNA序列，同时利用流式细胞荧光分选技术（Fluorescence activated Cell Sorting，FACS）等方法证实其参与调控猪卵泡颗粒细胞凋亡过程[11]。然而，目前对于猪NORFA基因的研究还处于起步阶段，关于其序列特征等基本信息还不清楚。因此，本试验拟在前期研究的基础上，以我国知名高产猪种梅山猪为研究对象，以大白猪作为对照，通过对中外不同猪种NORFA基因全序列及5’调控区序列进行克隆扩增，同时利用生物信息学手段分析其特征序列和结构组成，并对其潜在的SNP位点进行筛选，尝试从多个角度对猪NORFA基因进行更深层次的了解，研究结果为深入揭示其表达调控机制、利用分子标记提高母猪繁殖力提供一定理论依据。
1 材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验动物
梅山猪耳组织样采自于江苏省小梅山猪育种中心，大白猪耳组织样采自于江苏省永康农牧科技有限公司，耳组织样品采集后立即置于于液氮中保存，带回实验室后用于猪基因组DNA的提取。
1.1.2主要试剂
（1）DNA提取试剂
裂解液、蛋白酶K（20mg/ml）、Tris饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇以及75%乙醇（DEPC水配置）；
（2）PCR扩增与克隆试剂
2 x LA PCRMIX聚合酶（TaRaKa公司），T载体（南京擎科生物有限公司），2000bp DNA marker（南京诺唯赞生物有限公司）；
（3）电泳缓冲溶液
10×TBE浓储液：依次加入108g Tris，55g硼酸，7.44g Na2EDTAH2O，溶于900ml去离子水中，最终定容至1L。使用时将浓储液稀释10倍，稀释为1×TBE工作液进行电泳。
1.5%琼脂糖胶：称取3g琼脂糖，置于500ml的锥形瓶中，加入200ml稀释后1×TBE电泳液，混合均匀后置于微波炉中加热至沸腾，稍冷却后加入6μL浓度为0.5μg/ml的Goldview染料，摇匀后做胶。
1.1.3试验仪器
梯度PCR仪
稳压电泳仪
电泳凝胶成像系统
低温高速离心机
可调式恒温金属浴
可调式微量移液器。
1.2试验方法
1.2.1 猪基因组DNA提取
采用常规酚氯仿法提取猪基因组DNA，具体过程如下：
（1）取适当大小的猪耳组织样品剪碎转移到1.5ml离心管中，加入800μL提前配置的DNA裂解液，同时加入30μ的蛋白酶K，将离心管密封后置于55℃恒温水浴锅中过夜；
（2）取出样品加入800μL的Tris饱和酚，颠倒混匀之后在4℃环境中12000rpm离心10min，离心后小心吸取上层的液体加入新离心管中（其他层勿扰动），加入等量Tris溶液饱和酚、氯仿和异戊醇混合液（比例为25:24:1），颠倒混匀后在4℃环境中12000rpm离心10min；
（3）小心吸取上清液放入新的离心管中，加入800μL三氯甲烷，颠倒混匀后4℃环境下12000rpm离心10min；
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1试验材料 2
1.2试验方法 3
1.2.1猪基因组DNA提取..3
1.2.2引物设计与合成3
1.2.3PCR扩增及检测4
1.2.4PCR产物的回收与测序4
1.2.5SNP位点的筛选鉴定与多态性分析.............4
2结果与分析....4
2.1猪NORFA基因与5’调控区PCR扩增结果.......................................................5
2.2猪NORFA基因核苷酸序列分...............................................................5
2.3猪NORFA基因5’调控区序列分析..............................................7
2. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
4猪NORFA基因与5’调控区多态位点筛选....................................7
3讨论.10
致谢11
参考文献12
猪NORFA基因克隆及SNP位点的筛选
引言
长链非编码RNA（Long noncoding RNA，LncRNA）是一类长度大于200 nt并且不具备开放阅读框（Open reading frame，ORF）或缺乏蛋白质编码能力的内源性非编码RNA[1,2]。与编码蛋白基因相比，lncRNA的物种间保守性较差并伴随较强的组织特异性与表达时空特异性等特点[3,4]。越来越多的证据表明lncRNAs在表观遗传学调控中扮演着重要角色，在个体生长、发育及病变进程中广泛参与多种细胞生物学过程，比如细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、细胞分化、细胞迁移、侵袭以及癌变等[57]。在人类中，lncRNAs表达和功能异常与多种严重危害健康的重大疾病如退行性神经疾病、心血管疾病，以及白血病、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等肿瘤发生[810]等密切相关。因此，LncRNA正迅速成为继miRNAs之后非编码RNAs研究领域的新热点。
实验室前期在猪卵巢颗粒细胞中鉴定了一个与猪卵泡闭锁相关的新lncRNA即NORFA，并通过RNA末端快速扩增技术（Rapid amplification of cDNA ends，RACE）获得了猪NORFA基因RNA序列，同时利用流式细胞荧光分选技术（Fluorescence activated Cell Sorting，FACS）等方法证实其参与调控猪卵泡颗粒细胞凋亡过程[11]。然而，目前对于猪NORFA基因的研究还处于起步阶段，关于其序列特征等基本信息还不清楚。因此，本试验拟在前期研究的基础上，以我国知名高产猪种梅山猪为研究对象，以大白猪作为对照，通过对中外不同猪种NORFA基因全序列及5’调控区序列进行克隆扩增，同时利用生物信息学手段分析其特征序列和结构组成，并对其潜在的SNP位点进行筛选，尝试从多个角度对猪NORFA基因进行更深层次的了解，研究结果为深入揭示其表达调控机制、利用分子标记提高母猪繁殖力提供一定理论依据。
1 材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验动物
梅山猪耳组织样采自于江苏省小梅山猪育种中心，大白猪耳组织样采自于江苏省永康农牧科技有限公司，耳组织样品采集后立即置于于液氮中保存，带回实验室后用于猪基因组DNA的提取。
1.1.2主要试剂
（1）DNA提取试剂
裂解液、蛋白酶K（20mg/ml）、Tris饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇以及75%乙醇（DEPC水配置）；
（2）PCR扩增与克隆试剂
2 x LA PCRMIX聚合酶（TaRaKa公司），T载体（南京擎科生物有限公司），2000bp DNA marker（南京诺唯赞生物有限公司）；
（3）电泳缓冲溶液
10×TBE浓储液：依次加入108g Tris，55g硼酸，7.44g Na2EDTAH2O，溶于900ml去离子水中，最终定容至1L。使用时将浓储液稀释10倍，稀释为1×TBE工作液进行电泳。
1.5%琼脂糖胶：称取3g琼脂糖，置于500ml的锥形瓶中，加入200ml稀释后1×TBE电泳液，混合均匀后置于微波炉中加热至沸腾，稍冷却后加入6μL浓度为0.5μg/ml的Goldview染料，摇匀后做胶。
1.1.3试验仪器
梯度PCR仪
稳压电泳仪
电泳凝胶成像系统
低温高速离心机
可调式恒温金属浴
可调式微量移液器。
1.2试验方法
1.2.1 猪基因组DNA提取
采用常规酚氯仿法提取猪基因组DNA，具体过程如下：
（1）取适当大小的猪耳组织样品剪碎转移到1.5ml离心管中，加入800μL提前配置的DNA裂解液，同时加入30μ的蛋白酶K，将离心管密封后置于55℃恒温水浴锅中过夜；
（2）取出样品加入800μL的Tris饱和酚，颠倒混匀之后在4℃环境中12000rpm离心10min，离心后小心吸取上层的液体加入新离心管中（其他层勿扰动），加入等量Tris溶液饱和酚、氯仿和异戊醇混合液（比例为25:24:1），颠倒混匀后在4℃环境中12000rpm离心10min；
（3）小心吸取上清液放入新的离心管中，加入800μL三氯甲烷，颠倒混匀后4℃环境下12000rpm离心10min；
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