果蝇味觉受体的分布及功能
果蝇味觉受体的分布及功能[20200507184507]
摘要：有害昆虫不仅传播病原，造成每年数亿人感染，还破坏粮食作物，给世界农业生产造成巨大损失。由于化学感受是昆虫生存所必须，所以通过干扰昆虫的化学感受可实现对有害昆虫的控制。昆虫的化学感受系统包括嗅觉和味觉。其中，味觉系统主要感知非挥发性化学物质。目前，相对于嗅觉系统，昆虫味觉系统的分子细胞机制仍不清楚。已有的研究发现果蝇共有68种味觉受体，可能分布在唇瓣、翅膀、腿、生殖器等部位。本文通过遗传学和行为学实验，利用绿色荧光蛋白标记表达特定味觉受体的神经元，通过荧光检测确定了34种味觉受体的表达分布，并通过果蝇味觉行为学实验确定了翅膀上的糖类受体可介导果蝇的进食行为。本文的结果进一步加深了对味觉系统分子机制的了解，并为设计新的害虫防治策略提供重要理论指导。
关键字：果蝇；味觉受体；味觉受体神经元；绿色荧光蛋白；翅膀；口器伸缩反应
Expression and Function of Drosophila Gustatory Receptors
Student majoring in veterinary medicine Yanmin Ju
Tutors Donggen Luo (Peking University) and Yuanshu Zhang
Abstract：Insects transmit diseases to hundreds of millions of people per year, and cause enormous damage to the world’s agricultural crops. As chemoreception is crucial for insect survival, we can control insects by interfering their chemical sensation. Insects detect chemicals through the senses of olfaction and taste. Nonvolatile chemicals are detected by gustatory system. Unlike the well-studied sense of olfaction, we know little about insect gustatory system. Recently, 68 gustatory receptors (GRs) have been cloned. Combing Drosophila genetics and behavior experiments, we studied the expression and function of most Drosophila GRs. We found that the wings can drive feeding behavior of Drosophila. Our results reveal molecular mechanisms of Drosophila gustation, but also provide guidance for the designing of novel strategies of insect control.
一些携带疾病(疟疾，黄热病、锥虫病等)病源的昆虫可严重危害人类健康。仅由蚊子传播的疟疾每年导致一百多万人死亡。另外，粮食作物也易受到如小麦瘿蚊，绿叶蝉(大米)，玉米螟虫蛾和马铃薯甲虫等昆虫的破坏[1]。所以，有效地控制有害昆虫，是提高人类健康、促进世界各国经济的迫切需求。
昆虫的觅食、交配和产卵行为都依赖于对特定化学分子的识别。其中挥发性物质通过昆虫的嗅觉系统感知；而非挥发性的化学物质由味觉系统来感知。过去几十年的研究使我们对嗅觉系统在分子和细胞水平上已有较好的认识，但对味觉的分子细胞机制知之甚少。
果蝇通过身体表面的毛状感受器（sensillum）来识别与味觉相关的化学分子。这些味觉感受器是一类单孔感受器（化学分子通过这一端部的孔道而与味觉神经元相作用），主要分布于唇瓣、翅缘、生殖器和跗趾上等[2]。其中，唇瓣是果蝇主要的味觉器官每个唇瓣上有31个毛状味觉感受器，根据感受器长度分为三类：长型、中间型、短型。毛状感受器内有2-4个分别感受糖、水、低浓度盐或高浓度盐及苦味物质的神经元[3]。电镜和光镜观察表明，大多数感受器内还有一个机械感受神经元。
位于味觉感受器内的神经元均为双极神经元。其中，味觉感受神经元的树突伸入到毛状感受器的端部。引起味觉的化学分子通过毛状感受器端部的小孔进入，与味觉神经元树突表面上的味觉受体结合，通过信号转导机制被转换为神经电信号。这种神经电信号通过轴突以动作电位的形式传送到中枢神经系统进行加工处理[4]。在动物形成特定的味觉感知后，动物将作出适当的行为反应来适应外部的化学分子刺激。
昆虫味觉领域内的突破性进展来自于2003年对黑腹果蝇（D.melanogaster）味觉受体（Gustatory Receptors, GRs）的发现。根据果蝇不完全的基因组信息，Carlson实验室发现了一个拥有39个基因的味觉受体家族。这些味觉受体类似于哺乳动物的嗅觉受体，都属于有7个跨膜域的G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors，GPCR)家族[5]。随后，通过对果蝇全基因组序列的分析，Robertson HM等人发现果蝇有60个味觉受体基因（gustatory receptors gene, Gr），这些基因编码了68个味觉受体。这些受体间的氨基酸序列相似性较低(15%～25%)，提示了味觉受体家族识别各种化合物的功能多样性[6]。
根据味觉受体基因的序列特征，以及它们在味觉器官中表达的特征，可以推测这些基因主要编码了味觉受体蛋白。近几年的研究证实Grs确实在化学感受中发挥重要作用，如在甜味、苦味和非挥发性信息素的检测。同时，研究还提示Gr可能参与了温度等感觉刺激的检测[7]。
本文通过遗传学和行为学实验，研究果蝇味觉受体的表达分布及其功能。本文的研究成果将为探究味觉信号的产生、传递及中枢神经系统对信号加工最终调控昆虫取食、交配等行为的分子机制建立研究基础；为针对味觉系统设计新的害虫防治策略提供重要思路。
1 材料与方法
1.1 果蝇饲养
1.1.1 果蝇生活史
果蝇的生活史从受精卵开始，经历幼虫、蛹和成虫阶段，是一个完全变态过程。18-29℃条件下，9-15d完成一个世代。羽化出的成虫在8～12h后开始交配，25℃条件下的成虫寿命为30d。
1.1.2 饲养条件
实验室果蝇均在bottle和vial内饲养，饲养环境维持在18-29℃，保持12h光照，12h黑暗。在最佳饲养条件下（25℃，60%相对湿度），从卵到成虫仅约需9-10天。
1.1.3 培养基的配制
1.1.3.1 培养基配方
表1. 培养基配方
Table 1.medium components
成分 含量
玉米面 858g
葡萄糖 516g
蔗糖 258g
酵母粉 155g
球脂 32-45g
蒸馏水 9700ml
酸A 100ml（41.8ml丙酸+146.5μl85%磷酸+50ml超纯水）
对羟基苯甲酸甲酯 7g对羟基苯甲酸甲酯+70ml 95%乙醇
1.1.3.2 培养基制作
将除酸A、对羟基苯甲酸甲酯以外的固体物质称量后，倒入锅内，加蒸馏水，边加热边搅拌。待沸腾后，停止加热，再搅拌几分钟后让其自然冷却。当温度低于70℃加入酸A、对羟基苯甲酸甲酯，混匀后立即分装于bottle及vial内
1.1.4 果蝇辨别与收集
1.1.4.1 雄雌辨别
雌雄果蝇具有以下区别：①雄性个体一般较雌性小；②雄蝇前腿有性梳，雌蝇没有；③雄性腹部背面有三条黑条纹，最后一条极宽，并延伸到腹面，雌性腹部背面有五条黑条纹；④雄性腹部末端圆，雌性尖。
1.1.4.2 处女蝇的收集
一般来说，雌性果蝇在其羽化后的一段时间内不会与雄性果蝇交配，在温度为25℃时，为6-8小时，在18℃时，为13-16小时。选择白天25℃培养，晚上18℃过夜。白天每隔5小时收集一次，一天收集三次。严格按照处女蝇特征：身体苍白、在腹部的任何位置会出现蛹便。收集处女蝇在保存期5天左右，若管内没有幼虫蠕动，可保证为处女蝇。
1.1.4.3 雄蝇的收集
按照雄蝇特征进行收集。其中，3-10日龄的雄蝇交配效率高，1只雄蝇可与多只雌蝇交配。
1.1.5 果蝇的传代培养
果蝇每3周传代一次，vial内放15只左右，bottle内放40只左右，雌雄比例约为2:1。具体操作：将果蝇磕到培养基底部（但不能被食物黏住），迅速拔掉瓶塞，将一个新瓶子口对口倒置于旧瓶上，瓶口对准，将瓶子翻过来，轻磕使旧瓶中的果蝇转到新瓶子中（注意力度，不要将旧瓶里的食物也转到新瓶里），然后快速将新瓶子塞好，做好标记。
1.2 构建Gr- GFP果蝇
1.2.1 GAL4/UAS系统简介
半乳糖调节上游启动子元件(galactose- regulated upstream promoter element，GAL4)，是酵母中类似于原核生物乳糖操纵子的一个转录激活子。上游激活序列(upstream active sequence, UAS)，是酵母中一种类似高等真核生物增强子的一个序列。GAL4与UAS结合后，调控与半乳糖代谢相关基因的表达。GAL4在果蝇的特定组织中表达后，能以组织特异性的方式激活UAS下游基因的转录[8]。
GAL4/UAS系统的原理：利用组织特异性的启动子或增强子，将GAL4基因与启动子或增强子相连接，建立GAL4转基因系，通过这种启动子以细胞和组织特异性的方式来控制GAL4的表达；同时，将UAS与靶基因融合，建立UAS-靶基因转基因系。因GAL4转基因系中有转录激活子，但没有靶基因；UAS-靶基因系中没有激活子，靶基因处于沉默状态。故，只有将GAL4转基因系与UAS-靶基因系进行杂交，才能产生表达靶基因的后代[9]。
1.2.2 果蝇遗传学基础
果蝇有四对同源染色体，其中第一条染色体为性染色体。雄性果蝇同源染色体完全无重组现象，而雌性除第4条染色体外均有重组现象。Balancer是果蝇杂交最重要的工具，由射线引起的染色体大量断裂和重接，使平衡染色体中整个正常染色体的顺序变乱。其不与同源染色体发生重组，从而保持了突变基因的完整性。目前我们实验室的balancer均为纯合致死，得到的子代为balancer或非balancer的纯合子[10]。常见Balancer有：FM7a, CyO, TM2, TM3, TM6B等。Balancer一般携带特定的标记基因，表现出特定的性状。如CyO，标记基因Curly，性状为卷翅；TM3，标记基因Sb，性状粗短毛。
由于balancer染色体不与同源染色体发生同源重组，并且一般携带特定的标记基因，故可由标记基因同时确认balancer染色体和其同源染色体的去向。因此可以通过特定组合的性状或表型从后代中选择出特定基因型的个体。另外，由于实验室所用的balancer染色体都是纯合致死的，所以对于某种基因，当其所在染色体的同源染色体是balancer时，它是不会发生重组且可以稳定遗传下去的。
1.2.3 Gr-GFP果蝇的构建方法
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是27kDa的小分子量蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光。GFP位于核外，但所激发的荧光集中在细胞核内，在胞质内也可检测到一定的荧光[11]。mCD8是一种跨膜糖蛋白，作为T细胞受体的共表达受体，能与主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）结合。若在神经元内将mCD8与GFP共表达，能使GFP转移到膜上，从而可判断神经元的胞体、树突及轴突投射。
利用Gal4/UAS系统，把特异性味觉受体基因的启动子与GAL4融合建立Gr-GAL4转基因系，使特异性Gr启动子直接调控GAL4转录；以绿色荧光蛋白(GFP)为靶基因，建立UAS-mCD8-GFP转基因系，通过GFP蛋白发出的荧光亮度检测Gr的分布情况。
已知所有Grs均位于果蝇的第二和第三条染色体。实验室已有基因型为UAS-mCD8-GFP；UAS-mCD8-GFP/CyO的果蝇，以及基因型Gr-GAL4/CyO; Dr/TM3和Sp/CyO; Gr-GAL4/TM3果蝇，共66种，GAL4分别位于果蝇的第二、三条染色体上。将GAL4转基因系与UAS转基因系的果蝇杂交，因为UAS-mCD8-GFP位于第一条染色体上，故只要存在X染色体，便有UAS-GFP基因，但我们希望第二条染色体上也有UAS-GFP，这样特定的GRN就具有更高的荧光强度，更易区分。故果蝇杂交按以下方法进行：
a. 位于第二条染色体上Gr的杂交：
亲本杂交后，不论正反交，挑选出无CyO（卷翅）表型的子一代果蝇，即基因型为Gr-Gal4/UAS-mCD8-GFP的果蝇。
b. 位于第三条染色体上Gr的杂交：
若Sp/CyO; Gr-GAL4/TM3为父本，UAS-mCD8-GFP/CyO为母本，子一代定表达GFP，只需挑选无TM3（粗短毛）表型的果蝇
若UAS-mCD8-GFP/CyO为父本，Sp/CyO; Gr-Gal4/TM3为母本，子一代雌性果蝇定表达GFP，只需按照无TM3表型挑选；子一代雄性果蝇挑选无Sp（胸毛多）或CyO（两者不能均有）且无TM3的表型即可。
要注意的是，子一代果蝇基因型并不能稳定遗传，故只能用此代的果蝇进行实验。
1.3 检测Grs表达部位
1.3.1 果蝇各器官的解剖
向chamber内注入ringer（108mM NaCl, 3.0mM KCl, 4.0mM MgCl2, 1.5mM CaCl2, 26mM NaHCO3）。用二氧化碳将果蝇麻醉后，将果蝇的唇瓣、触须、脑、腿、翅膀和生殖器分别分离，转入chamber，并将其固定在chamber底部。
1.3.2 荧光检测
在荧光显微镜观察特定Gr- GFP果蝇各器官的标本，若看到发出绿色荧光的胞体，说明特定Gr分布在该部位GRN上。本文使用了两种观察方法：a.普通荧光显微镜法，先在DIC状态下观察，电脑采集图像；再在荧光状态下观察，找到被GFP标记的胞体，采集图像，对比两种光源下的图片，确保所见胞体在标本上; b.激光扫描共聚焦法，其操作步骤基本同上。因采用逐点扫描技术，图像采集速度慢，但图像分辨率更高。
1.4 味觉行为学实验（PER）
1.4.1 PER实验原理
口器伸缩反射（proboscis extension reflex，PER）是果蝇的一种自发反射，在平时就会随机出现口器伸缩行为，但当用甜味物质刺激果蝇的毛状感受器（通常是腿部的）时，口器伸缩频率显著提高，而当用甜味、苦味混合物刺激时，与只用甜味物质相比，频率会有所下降[12]。利用此种行为学特征，可直接研究甜味或苦味神经元是否存在特定部位，也可实现直接研究特定GRN对不同味道的化学物质的反应，分析特定部位GRN的特征。
本文是采用水和甜味刺激野生型果蝇的翅膀，观察口器是否伸缩，以此来判断翅膀上是否存在可介导果蝇的进食行为糖类受体。
1.4.2 实验方法
实验所用为野生型果蝇。实验前，挑选1-2日龄雌蝇，在有充足水的条件下，饥饿24h。24h后，用冰将麻醉。挑出腹部干瘪、个大、健壮的果蝇，剪去腿，再将果蝇背部固定于银丝的一端。
依次用干燥、蘸有水、甜味混合刺激物（Mixture, 0.5M sucrose, 0.5M glucose, 0.5M fructose,0.5M trehalose）的纸条刺激翅膀的外侧缘，观察口器伸缩长度，再用0.1M sucrose刺激唇瓣，观察口器伸缩长度，并参考1965年Dethier等人[13]的评估方式打分。此操作连续重复三次。
图1 味觉行为学实验，10×
Figure1. proboscis extension reflex，10×
左：将饥饿的果蝇固定在蘸有胶水的银丝末端；右：用蘸有水或糖水的小纸条刺激翅膀外缘 Left: fix the starving fly in the end of the silver, which has been dipped in specific glue; Right: stimulate wing with a slip, which has been dipped in water or sugar solution
1.4.3 实验数据的处理
若用干燥纸条刺激果蝇，出现口器伸缩反应，则该果蝇排除统计范畴。
若用0.1M sucrose刺激唇瓣无反应，则该果蝇可能死亡或活性不佳，亦排除统计范畴。
同一只果蝇重复三次试验，其中只要出现一次口器伸缩反应，则纳入统计范畴。
若只有用0.1M sucrose刺激唇瓣才出现口器伸缩反应，统计时认为无效数据，记为“-”
若用水或Mixture刺激翅膀有口器伸缩反应，不论反应剧烈程度，统计时均认为有效数据，记为“+”。
2 结果与分析
黒腹果蝇体内共表达68种Grs，本文构建了其中34种Grs的表达图谱。这34种Grs为：Gr2a, Gr5a, Gr8a, Gr10a, Gr21a, Gr22a, Gr22b, Gr22c, Gr22d, Gr28a, Gr28ba, Gr28bb, Gr28bc, Gr28bd, Gr28be, Gr39aa, Gr39ad, Gr43a, Gr47a, Gr58a, Gr59d, Gr61a, Gr63a, Gr64e, Gr64f, Gr77a, Gr85a, Gr89a, Gr92a, Gr93c, Gr93d, Gr94a, Gr98b,Gr98c，均位于第二条染色体。
2.1 34种Grs的表达图谱
利用GAL4/UAS系统成功构建了34种Gr-GFP果蝇。将这34种果蝇解剖，把每种果蝇的唇瓣(labellum), 触须(antenna), 脑(brain), 腿(leg), 翅膀(wing), 以及生殖器(genitor)制成标本，进行荧光检测，记录，得到统计结果见表2.
表2 34种Grs在果蝇各器官的分布
Table2 The expression of 34 kinds of Grs in drosophila’s different organs
Organs Labellum Antenna Brain Leg Wing Genitor Male Female
Gr2a + - + - - - +
Gr5a + - + + - + +
Gr8a + - + + - + -
Gr10a - - - - - - -
Gr21a + + + - - - -
Gr22a - - - + - - -
Gr22b + - + + - - -
Gr22c + - + + - - -
Gr22d + - - - - - -
Gr28a + - + - - - -
Gr28ba + - + + - + -
Gr28bb + + + + + - -
Gr28bc + - + + + - +
Gr28bd + + （arista+） + + + + +
Gr28be + - + + - + -
Gr39aa + - + - - - -
Gr39ad + - + - - + -
Gr43a + - + + - - -
Gr47a + - - - - - -
Gr58a - - - - - + +
Gr59d + - + + - + -
Gr61a + - + + - + -
Gr63a - + + - - + -
Gr64e + - + + + + -
Gr64f + + + + - - -
Gr77a + - + - - - -
Gr85a + - - - - - -
Gr89a + - + + + - -
Gr92a + - + - - - +
Gr93c + - - - - - +
Gr93d + - + - - + +
Gr94a - - - - - - -
Gr98b + - + - - - -
Gr98c + + + - - - +
“+”：在该部位检测到有特定Gr表达；“-”：在该部位未检测到特定Gr表达 “+”: Specific Gr expression was detected in this organ;“-”: No specific Gr expression was detected in this organ
由表2可见，果蝇同一部位有多种Grs表达，而同一种Gr也可表达在果蝇的多个部位。
2.1.1 Grs在唇瓣的分布
唇瓣是果蝇最主要的味觉器官，其上有大量的Grs分布，在统计的34种Grs种，有29种在唇瓣上表达。在荧光检测中观察发现，不同Grs标记的GRN的数量存在较大差异，故对特定Grs标记的GRN数量进行详细统计，得到结果见表3。
表3 34种Grs标记的GRNs在唇瓣中表达量
Table3 The expression number of GRNs marked by 34 kinds of Grs in the labellum
Neuron NumberKinds of Grs
010a,22a,58a,63a,94a
1~52a,21a,28a,28bc,28bd,47a,77a,85a,92a,93c,93d,98c,98b,22c,22d
6~108a,22b,28be,39ad,43a,59d,61a
>105a,28ba,64e,64f,89a
由表3可知，有5种Grs（5a,28ba,64e,64f,89a）在唇瓣上大量表达。唇瓣是果蝇用来摄取食物的器官，这些Grs在唇瓣上大量表达提示着它们在味觉的识别中作用很大。已有文献报道，Gr5a是海藻糖的受体，在甜味的识别中起来至关重要的作用，为糖神经元表面的标志性受体[14]。下图为Gr5a在果蝇唇瓣中的表达图谱。
图2 Gr5a在果蝇唇瓣中的表达图谱
Figure2 the expression pattern of Gr5a in the labellum
左图10X；右图60X Left 10X; Right 60X
由图2可见，唇瓣上绝大部分的神经元都表达Gr5a。本实验结果中，发现存在其它Grs在唇瓣中的表达图谱和Gr5a表达图谱很像，如Gr64f、Gr61a等。我们猜测可能和Gr5a有共定位。因Gr5a是识别甜味的受体，和Gr5a有共定位作用的Grs很有可能也起了识别甜味的作用。下图为Gr64f在果蝇唇瓣中的表达图谱。
图3 Gr64f在果蝇唇瓣中的表达图谱
Figure3 the expression pattern of Gr64f in the labellum
左图10X；白色刻度线：50μm Left 10X: White bar: 50μm
除了一些和Gr5a表达类似的Grs外，还有很多是单独表达的，猜测这些Grs可能起了识别其他味觉的作用，比如苦味，酸味，咸味等。这些都有待我们去研究发现。
2.1.2 Grs在触须的分布
触须是果蝇重要的嗅觉器官，表面分布着3种不同形态的sensilla[15]。气味分子通过sensilla上广泛分布的小孔进入，与嗅觉神经元表面的受体接触，从而感知气味。猜测分布在触须上的6种Grs：Gr21a, Gr28bb, Gr28bd, Gr63a, Gr64f, Gr98c，其作用可能不是感受味道分子，而是与嗅觉受体类似，感受气味分子。已有报道称Gr21a,Gr63a共异位表达在非CO2敏感的嗅觉神经元中，用于感受CO2浓度变化[16]。
图4 Gr21a(上)，Gr28bd（下）在果蝇触角中的表达图谱
Figure4 the expression pattern of Gr21a(above), Gr28bd(below) in the antenna
左图10X；右图60X Left 10X; Right 60X
由图4、5可见，Gr28bd不仅表达在触须上，触须芒(arista)上也有表达。图5中，Gr28bd表达在触须芒基部及柄部，这与2013年Ni L.等人报道的Gr28bd表达部位一致，他们发现Gr28bd表达在该部位热神经元上，感受迅速变化的环境温度[17]。当温度快速升高时，使果蝇产生迅速行为反应。
图5 Gr28bd在果蝇触须芒的表达图谱
Figure5 the expression pattern of Gr28bd in the arista
左图10X；白色刻度线：20μm Left 10X; White bar: 20μm
2.1.3 Grs在脑的分布
由表2可见，有26种Grs在大脑中表达。大部分Grs在脑中的作用我们并不清楚。其中，有报道称，Gr43a是果糖受体，在脑中具有营养传感器的功能。它不但能感受血糖中的果糖浓度，而且还能调节果蝇的进食行为。当果蝇饥饿时，促进果蝇进食；反之，抑制其进食[18]。由此，猜测其余表达在脑中的Grs可能有同Gr43a类似的功能，能够与内源性物质结合，从而调控果蝇行为。这些有待我们进一步研究。
图6 Gr28bd（左）、Gr28bc（中）、Gr43a（右）在果蝇大脑中的表达图谱
Figure6 the expression pattern of Gr28bd(left), Gr28bc(media), Gr43a（right）in the brain
上图10X；下图60X Above10X; Below 60X
2.1.4 Grs在腿的分布
腿是果蝇另一个重要的味觉器官，跗趾是感受味觉的主要部位，其上分布着大量sensilla。当果蝇着落在食物上时，跗趾上的sensilla通过接触食物，感受到食物的味道。与唇瓣的Grs分布情况相比，发现16种分布在腿上的Grs中有15种同时也分布在唇瓣上，这表明果蝇用腿就能识别较多的味道。在前腿，雄性有50个sensilla，而雌性只有37个。在雌雄交配时，会出现雄性用前腿拍雌性腹部的有趣现象。有报道称，这些雄性特异性的sensilla可能是用于识别雌性发出的信息素[19]。这一信息提示，表达在腿上的Grs不仅能感受味道分子，还可能识别信息素。
图7 Gr61a在果蝇腿中的表达图谱
Figure7 the expression pattern of Gr61a in the leg
左图10X；右图60X Left 10X; Right 60X
2.1.5 Grs在翅膀的分布
有关Gr的文献中都会提到翅膀边缘有味觉感器分布，然而至今未有文献揭示果蝇翅膀外源Gr的功能。本实验结果表明，有4种Grs：Gr28bd,Gr8bb,Gr28bc,Gr64e表达在翅膀的外缘上。果蝇在果树间飞翔时，翅膀可能会感受到某些分子，吸引果蝇过去吃水果，猜测这些Grs可能具有识别味道的功能。然而，本文发现Grs的表达部位并不局限于翅膀外缘，还表达在翅膀中间，如图8所示，Gr89a表达在第三翅脉上。猜测Gr89a可能起了其他作用。
图8 Gr28bb在果蝇翅膀中的表达图谱
Figure8 the expression pattern of Gr28bb in the wing
左图10X；右图60X Left 10X; Right 60X
图9 Gr89a在果蝇翅膀中的表达图谱
Figure9 the expression pattern of Gr89a in the wing
左图10X；白色刻度线：20μm Left 10X; White bar: 20μm
2.1.6 Grs在生殖器的分布
由表2可见，生殖器上的Grs分布具有性别特异性。Gr5a,Gr28bd,Gr58a,Gr93d在雌雄体中均有表达，猜测它们参与异性识别的可能性较小。雄性特异性表达的Grs可能在交配中发挥作用，感受异性发出的吸引性信息素以及同性发出抑制性信息素。而雌性特异性Grs可能与产卵行为有关，雌性果蝇在产卵时需要找到营养丰富的环境，提高后代的存活率。
图10 Gr28bd（上），Gr28bc（下）在雌蝇生殖器中的表达图谱
Figure10 the expression pattern of Gr28bd(above), Gr28bc(below) in the female genitor
左图10X；右图60X Left 10X; Right 60X
图11 Gr64f（上），Gr28bd（下）在雄蝇生殖器中的表达图谱
Figure11 the expression pattern of Gr64f（above），Gr28bd（below）in the male genitor
左图10X；右图60X Left 10X; Right 60X
2.2 味觉行为学实验结果
目前还没有关于翅膀上Gr的报道，而我的实验结果发现在翅膀上有Gr的表达。若能阐释果蝇翅膀上的味觉受体的功能，这将是果蝇味觉研究领域中比较重要的突破。
以野生型雌性果蝇作为实验对象，共进行6组实验，每组果蝇19-24只，统计得到如下结果：
表4. 水、糖水混合物刺激果蝇翅膀的NIPER值
NIPER W-S+ W+S+ W-/+S+
NO.1 15.7% 36.8% 52.6%
NO.2 9.0% 40.1% 49.1%
NO.3 9.5% 28.5% 38.1%
NO.4 10.5% 42.1% 52.6%
NO.5 13.0% 47.8% 60.8%
NO.6 13.0% 34.7% 47.8%
Mean 11.8% 38.3% 50.1%
“W” water, “S” sugar mixture; NIPER= NPER/ Ntota “+”刺激后出现口器伸长; ”-”刺激后未出现口器伸长 “+”proboscis extended after stimulus; “-” proboscis didn’t extend after stimulus
由表4可见，实验中Mixture刺激出现口器伸长（W-/+S+）的NIPER为50.1%，其中先后用水、Mixture刺激均有口器伸长（W+S+）的NIPER为38.3%，先用水刺激无反应后用Mixture刺激出现口器伸长（W-S+）的NIPER为11.8%。因为Mixture中包含了糖分子和水分子，而典型的sensilla中有四种神经元：甜味神经元、苦味神经元、水神经元和盐神经元，为排除因为Mixture刺激水神经而引起伸缩反应的可能，故在实验中先用水刺激翅膀。可以看到用水刺激未产生反应时再用Mixture刺激口器可出现伸长现象，这证明翅膀上存在糖类受体，并且能介导果蝇的进食行为。同时，水刺激翅膀也会出现口器伸缩反应，这说明翅膀上也存在水神经元。但实验中并不是所有果蝇都出现反应，这可能跟刺激的部位有关，当用蘸有Mixture小纸条去刺激翅膀时，不能保证特定GRN所在sensilla每次都能与Mixture中的糖分子接触。
3 讨论
哺乳动物只有唯一的味觉感受器官——舌头，而果蝇的味觉系统远比其复杂。果蝇有68种味觉受体，唇瓣、翅缘、生殖器官和跗趾上均表达分布。同一部位可有多种Grs表达，而同一种Gr也可表达在多个部位。这些都增加了研究果蝇味觉受体的难度。
目前部分Grs的功能研究已有一些进展。Gr5a是果蝇Gr家族中分布最广泛的Gr受体，主要感受trehalose，是糖神经元中的标志性受体。Gr66a在唇瓣的短型、中间型sensilla中均有表达，是感受咖啡因的受体，同时也是苦味神经元的标志性受体[20]。此外，发现Grs不仅表达在GRN上，还能表达在其它与味觉无关的神经元或组织中。Gr21a,Gr63a共异位表达在非CO2敏感的嗅觉神经元中，感受CO2浓度变化。Gr28bd表达在热神经元上，感受迅速变化的环境温度。尽管如此，大部分Grs的功能仍是未知。
本文通过遗传学和行为学实验，研究果蝇味觉受体的表达分布及其功能。利用绿色荧光蛋白标记表达特定味觉受体的神经元，通过荧光检测确定了34种味觉受体的表达分布，并通过果蝇味觉行为学实验证明翅膀上存在糖类受体，并且可以介导果蝇的进食行为。研究成果具有十分重要的意义，首先，它是阐明GRN受体接受外界信号至将信息传递到大脑，从而使昆虫对外界信号作出行为反应的基础理论，其次，Grs功能的研究能够应用到生产实践，如敲除或沉默控制雌蝇产卵行为的Grs，能使果蝇的繁殖率大大降低，从而应用于控制虫害，实现保护人类健康和减少农业损失。
可从多个方面展开下一步的研究。第一，是分布在翅膀上的Grs功能的研究。本文结果确定了在翅膀上有Gr28bd,Gr8bb,Gr28bc,Gr64e表达，且能够感受糖类、介导果蝇的进食行为。但具体是哪个或哪些味觉受体在发挥作用我们并不知道。在下一步的研究中，可利用钙成像技术，通过观察钙离子介导的信号传递过程[21]，确定与糖类分子识别相关的Gr。此外，本文发现存在分布在翅中的Gr89a，其功能可能与识别味道无关，对它的研究思维应不局限在味觉领域。
第二，分布在触角上的Grs功能的研究。本文发现Gr21a, Gr28bb, Gr28bd, Gr63a, Gr64f, Gr98c在果蝇的嗅觉器官触角上表达分布。猜测它们功能可能与嗅觉受体类似，对于它们的研究可利用嗅觉系统较成熟的研究方法。
第三，是对于已知功能Gr的味觉信号传导机制的研究。目前，虽然已经知道了一些Grs的功能，但Gr与味道分子结合后如何产生信号分子并进行信号传递以及中枢神经系统对信号加工最终调控昆虫行为的分子机制，大家仍不清楚。利用电生理技术用不同味道的物质刺激特异性表达某种Gr的sensilla，记录sensilla内GRN的电生理活动，根据电生理变化曲线推测味觉系统的传导机制。
此外，作为味觉受体家族的一员——Gr10a未表达分布在成年果蝇的任何部位。因为果蝇变态发育过程中幼虫和成虫的形态差异较大，根据用进废退理论，可能Gr10a在幼虫上有表达且具有一定功能但成虫后不再需要此功能所以Gr10a未表达。可以尝试在果蝇幼虫上寻找Gr10a的表达分布。
致谢
在北京大学做毕业论文的这三个多月的时光中，我深深地被实验室良好的科研氛围所打动，收获颇丰，这段时光已成为我人生中的一笔宝贵的财富，我会牢记这段时光。在此，我衷心地感谢给过我帮助和鼓励的每一个人。
非常感谢我的另一个导师——大学的张源淑教授，谢谢您这五年来对我学习生活的关心，谢谢您允许我到北京大学做毕业论文并且时时关心我的实验进展。您对学生总是那么和蔼可亲，祝您今后工作和生活一切顺心！
感谢我的家人，感谢他们对我的养育之恩，感谢他们对于我多年的教育培养。
最后，感谢各位评委在百忙之中抽空认真审阅我的论文！
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1果蝇饲养2
1.1.1果蝇生活史2
1.1.2 饲养条件2
1.1.3 培养基的配制2
1.1.4 果蝇辨别与收集3
1.1.5 果蝇的传代培养3
1.2 构建Gr-GFP果蝇3
1.2.1 GAL4/UAS系统简介3
1.2.2果蝇遗传学基础3
1.2.2 Gr-GFP果蝇的构建方法4
1.3检测Grs的表达部位4
1.3.1 果蝇各器官的解剖4
1.3.2 荧光检测4
1.4 味觉行为学实验（PER）5
1.4.1实验原理5
1.4.2 实验方法5
1.4.3 实验数据的处理5
2 结果与分析6
2.1 34种Grs的表达图谱6
2.1.1Grs在唇瓣的分布7
2.1.2 Grs在触角的分布8
2.1.3 Grs在脑的分布9
2.1.4 Grs在腿的分布9
2.1.5 Grs在翅膀的分布10
2.1.6 Grs在生殖器的分布11
2.2 味觉行为学实验结果11
3 讨论12
致谢12
参考文献13
果蝇味觉受体的分布及功能
引言
摘要：有害昆虫不仅传播病原，造成每年数亿人感染，还破坏粮食作物，给世界农业生产造成巨大损失。由于化学感受是昆虫生存所必须，所以通过干扰昆虫的化学感受可实现对有害昆虫的控制。昆虫的化学感受系统包括嗅觉和味觉。其中，味觉系统主要感知非挥发性化学物质。目前，相对于嗅觉系统，昆虫味觉系统的分子细胞机制仍不清楚。已有的研究发现果蝇共有68种味觉受体，可能分布在唇瓣、翅膀、腿、生殖器等部位。本文通过遗传学和行为学实验，利用绿色荧光蛋白标记表达特定味觉受体的神经元，通过荧光检测确定了34种味觉受体的表达分布，并通过果蝇味觉行为学实验确定了翅膀上的糖类受体可介导果蝇的进食行为。本文的结果进一步加深了对味觉系统分子机制的了解，并为设计新的害虫防治策略提供重要理论指导。
关键字：果蝇；味觉受体；味觉受体神经元；绿色荧光蛋白；翅膀；口器伸缩反应
Expression and Function of Drosophila Gustatory Receptors
Student majoring in veterinary medicine Yanmin Ju
Tutors Donggen Luo (Peking University) and Yuanshu Zhang
Abstract：Insects transmit diseases to hundreds of millions of people per year, and cause enormous damage to the world’s agricultural crops. As chemoreception is crucial for insect survival, we can control insects by interfering their chemical sensation. Insects detect chemicals through the senses of olfaction and taste. Nonvolatile chemicals are detected by gustatory system. Unlike the well-studied sense of olfaction, we know little about insect gustatory system. Recently, 68 gustatory receptors (GRs) have been cloned. Combing Drosophila genetics and behavior experiments, we studied the expression and function of most Drosophila GRs. We found that the wings can drive feeding behavior of Drosophila. Our results reveal molecular mechanisms of Drosophila gustation, but also provide guidance for the designing of novel strategies of insect control.
一些携带疾病(疟疾，黄热病、锥虫病等)病源的昆虫可严重危害人类健康。仅由蚊子传播的疟疾每年导致一百多万人死亡。另外，粮食作物也易受到如小麦瘿蚊，绿叶蝉(大米)，玉米螟虫蛾和马铃薯甲虫等昆虫的破坏[1]。所以，有效地控制有害昆虫，是提高人类健康、促进世界各国经济的迫切需求。
昆虫的觅食、交配和产卵行为都依赖于对特定化学分子的识别。其中挥发性物质通过昆虫的嗅觉系统感知；而非挥发性的化学物质由味觉系统来感知。过去几十年的研究使我们对嗅觉系统在分子和细胞水平上已有较好的认识，但对味觉的分子细胞机制知之甚少。
果蝇通过身体表面的毛状感受器（sensillum）来识别与味觉相关的化学分子。这些味觉感受器是一类单孔感受器（化学分子通过这一端部的孔道而与味觉神经元相作用），主要分布于唇瓣、翅缘、生殖器和跗趾上等[2]。其中，唇瓣是果蝇主要的味觉器官每个唇瓣上有31个毛状味觉感受器，根据感受器长度分为三类：长型、中间型、短型。毛状感受器内有2-4个分别感受糖、水、低浓度盐或高浓度盐及苦味物质的神经元[3]。电镜和光镜观察表明，大多数感受器内还有一个机械感受神经元。
位于味觉感受器内的神经元均为双极神经元。其中，味觉感受神经元的树突伸入到毛状感受器的端部。引起味觉的化学分子通过毛状感受器端部的小孔进入，与味觉神经元树突表面上的味觉受体结合，通过信号转导机制被转换为神经电信号。这种神经电信号通过轴突以动作电位的形式传送到中枢神经系统进行加工处理[4]。在动物形成特定的味觉感知后，动物将作出适当的行为反应来适应外部的化学分子刺激。
昆虫味觉领域内的突破性进展来自于2003年对黑腹果蝇（D.melanogaster）味觉受体（Gustatory Receptors, GRs）的发现。根据果蝇不完全的基因组信息，Carlson实验室发现了一个拥有39个基因的味觉受体家族。这些味觉受体类似于哺乳动物的嗅觉受体，都属于有7个跨膜域的G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors，GPCR)家族[5]。随后，通过对果蝇全基因组序列的分析，Robertson HM等人发现果蝇有60个味觉受体基因（gustatory receptors gene, Gr），这些基因编码了68个味觉受体。这些受体间的氨基酸序列相似性较低(15%～25%)，提示了味觉受体家族识别各种化合物的功能多样性[6]。
根据味觉受体基因的序列特征，以及它们在味觉器官中表达的特征，可以推测这些基因主要编码了味觉受体蛋白。近几年的研究证实Grs确实在化学感受中发挥重要作用，如在甜味、苦味和非挥发性信息素的检测。同时，研究还提示Gr可能参与了温度等感觉刺激的检测[7]。
本文通过遗传学和行为学实验，研究果蝇味觉受体的表达分布及其功能。本文的研究成果将为探究味觉信号的产生、传递及中枢神经系统对信号加工最终调控昆虫取食、交配等行为的分子机制建立研究基础；为针对味觉系统设计新的害虫防治策略提供重要思路。
1 材料与方法
1.1 果蝇饲养
1.1.1 果蝇生活史
果蝇的生活史从受精卵开始，经历幼虫、蛹和成虫阶段，是一个完全变态过程。18-29℃条件下，9-15d完成一个世代。羽化出的成虫在8～12h后开始交配，25℃条件下的成虫寿命为30d。
1.1.2 饲养条件
实验室果蝇均在bottle和vial内饲养，饲养环境维持在18-29℃，保持12h光照，12h黑暗。在最佳饲养条件下（25℃，60%相对湿度），从卵到成虫仅约需9-10天。
1.1.3 培养基的配制
1.1.3.1 培养基配方
表1. 培养基配方
Table 1.medium components
成分 含量
玉米面 858g
葡萄糖 516g
蔗糖 258g
酵母粉 155g
球脂 32-45g
蒸馏水 9700ml
酸A 100ml（41.8ml丙酸+146.5μl85%磷酸+50ml超纯水）
对羟基苯甲酸甲酯 7g对羟基苯甲酸甲酯+70ml 95%乙醇
1.1.3.2 培养基制作
将除酸A、对羟基苯甲酸甲酯以外的固体物质称量后，倒入锅内，加蒸馏水，边加热边搅拌。待沸腾后，停止加热，再搅拌几分钟后让其自然冷却。当温度低于70℃加入酸A、对羟基苯甲酸甲酯，混匀后立即分装于bottle及vial内
1.1.4 果蝇辨别与收集
1.1.4.1 雄雌辨别
雌雄果蝇具有以下区别：①雄性个体一般较雌性小；②雄蝇前腿有性梳，雌蝇没有；③雄性腹部背面有三条黑条纹，最后一条极宽，并延伸到腹面，雌性腹部背面有五条黑条纹；④雄性腹部末端圆，雌性尖。
1.1.4.2 处女蝇的收集
一般来说，雌性果蝇在其羽化后的一段时间内不会与雄性果蝇交配，在温度为25℃时，为6-8小时，在18℃时，为13-16小时。选择白天25℃培养，晚上18℃过夜。白天每隔5小时收集一次，一天收集三次。严格按照处女蝇特征：身体苍白、在腹部的任何位置会出现蛹便。收集处女蝇在保存期5天左右，若管内没有幼虫蠕动，可保证为处女蝇。
1.1.4.3 雄蝇的收集
按照雄蝇特征进行收集。其中，3-10日龄的雄蝇交配效率高，1只雄蝇可与多只雌蝇交配。
1.1.5 果蝇的传代培养
果蝇每3周传代一次，vial内放15只左右，bottle内放40只左右，雌雄比例约为2:1。具体操作：将果蝇磕到培养基底部（但不能被食物黏住），迅速拔掉瓶塞，将一个新瓶子口对口倒置于旧瓶上，瓶口对准，将瓶子翻过来，轻磕使旧瓶中的果蝇转到新瓶子中（注意力度，不要将旧瓶里的食物也转到新瓶里），然后快速将新瓶子塞好，做好标记。
1.2 构建Gr- GFP果蝇
1.2.1 GAL4/UAS系统简介
半乳糖调节上游启动子元件(galactose- regulated upstream promoter element，GAL4)，是酵母中类似于原核生物乳糖操纵子的一个转录激活子。上游激活序列(upstream active sequence, UAS)，是酵母中一种类似高等真核生物增强子的一个序列。GAL4与UAS结合后，调控与半乳糖代谢相关基因的表达。GAL4在果蝇的特定组织中表达后，能以组织特异性的方式激活UAS下游基因的转录[8]。
GAL4/UAS系统的原理：利用组织特异性的启动子或增强子，将GAL4基因与启动子或增强子相连接，建立GAL4转基因系，通过这种启动子以细胞和组织特异性的方式来控制GAL4的表达；同时，将UAS与靶基因融合，建立UAS-靶基因转基因系。因GAL4转基因系中有转录激活子，但没有靶基因；UAS-靶基因系中没有激活子，靶基因处于沉默状态。故，只有将GAL4转基因系与UAS-靶基因系进行杂交，才能产生表达靶基因的后代[9]。
1.2.2 果蝇遗传学基础
果蝇有四对同源染色体，其中第一条染色体为性染色体。雄性果蝇同源染色体完全无重组现象，而雌性除第4条染色体外均有重组现象。Balancer是果蝇杂交最重要的工具，由射线引起的染色体大量断裂和重接，使平衡染色体中整个正常染色体的顺序变乱。其不与同源染色体发生重组，从而保持了突变基因的完整性。目前我们实验室的balancer均为纯合致死，得到的子代为balancer或非balancer的纯合子[10]。常见Balancer有：FM7a, CyO, TM2, TM3, TM6B等。Balancer一般携带特定的标记基因，表现出特定的性状。如CyO，标记基因Curly，性状为卷翅；TM3，标记基因Sb，性状粗短毛。
由于balancer染色体不与同源染色体发生同源重组，并且一般携带特定的标记基因，故可由标记基因同时确认balancer染色体和其同源染色体的去向。因此可以通过特定组合的性状或表型从后代中选择出特定基因型的个体。另外，由于实验室所用的balancer染色体都是纯合致死的，所以对于某种基因，当其所在染色体的同源染色体是balancer时，它是不会发生重组且可以稳定遗传下去的。
1.2.3 Gr-GFP果蝇的构建方法
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是27kDa的小分子量蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光。GFP位于核外，但所激发的荧光集中在细胞核内，在胞质内也可检测到一定的荧光[11]。mCD8是一种跨膜糖蛋白，作为T细胞受体的共表达受体，能与主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex
利用Gal4/UAS系统，把特异性味觉受体基因的启动子与GAL4融合建立Gr-GAL4转基因系，使特异性Gr启动子直接调控GAL4转录；以绿色荧光蛋白(GFP)为靶基因，建立UAS-mCD8-GFP转基因系，通过GFP蛋白发出的荧光亮度检测Gr的分布情况。
已知所有Grs均位于果蝇的第二和第三条染色体。实验室已有基因型为UAS-mCD8-GFP；UAS-mCD8-GFP/CyO的果蝇，以及基因型Gr-GAL4/CyO; Dr/TM3和Sp/CyO; Gr-GAL4/TM3果蝇，共66种，GAL4分别位于果蝇的第二、三条染色体上。将GAL4转基因系与UAS转基因系的果蝇杂交，因为UAS-mCD8-GFP位于第一条染色体上，故只要存在X染色体，便有UAS-GFP基因，但我们希望第二条染色体上也有UAS-GFP，这样特定的GRN就具有更高的荧光强度，更易区分。故果蝇杂交按以下方法进行：
a. 位于第二条染色体上Gr的杂交：
亲本杂交后，不论正反交，挑选出无CyO（卷翅）表型的子一代果蝇，即基因型为Gr-Gal4/UAS-mCD8-GFP的果蝇。
b. 位于第三条染色体上Gr的杂交：
若Sp/CyO; Gr-GAL4/TM3为父本，UAS-mCD8-GFP/CyO为母本，子一代定表达GFP，只需挑选无TM3（粗短毛）表型的果蝇
若UAS-mCD8-GFP/CyO为父本，Sp/CyO; Gr-Gal4/TM3为母本，子一代雌性果蝇定表达GFP，只需按照无TM3表型挑选；子一代雄性果蝇挑选无Sp（胸毛多）或CyO（两者不能均有）且无TM3的表型即可。
要注意的是，子一代果蝇基因型并不能稳定遗传，故只能用此代的果蝇进行实验。
1.3 检测Grs表达部位
1.3.1 果蝇各器官的解剖
向chamber内注入ringer（108mM NaCl, 3.0mM KCl, 4.0mM MgCl2, 1.5mM CaCl2, 26mM NaHCO3）。用二氧化碳将果蝇麻醉后，将果蝇的唇瓣、触须、脑、腿、翅膀和生殖器分别分离，转入chamber，并将其固定在chamber底部。
1.3.2 荧光检测
在荧光显微镜观察特定Gr- GFP果蝇各器官的标本，若看到发出绿色荧光的胞体，说明特定Gr分布在该部位GRN上。本文使用了两种观察方法：a.普通荧光显微镜法，先在DIC状态下观察，电脑采集图像；再在荧光状态下观察，找到被GFP标记的胞体，采集图像，对比两种光源下的图片，确保所见胞体在标本上; b.激光扫描共聚焦法，其操作步骤基本同上。因采用逐点扫描技术，图像采集速度慢，但图像分辨率更高。
1.4 味觉行为学实验（PER）
1.4.1 PER实验原理
口器伸缩反射（proboscis extension reflex，PER）是果蝇的一种自发反射，在平时就会随机出现口器伸缩行为，但当用甜味物质刺激果蝇的毛状感受器（通常是腿部的）时，口器伸缩频率显著提高，而当用甜味、苦味混合物刺激时，与只用甜味物质相比，频率会有所下降[12]。利用此种行为学特征，可直接研究甜味或苦味神经元是否存在特定部位，也可实现直接研究特定GRN对不同味道的化学物质的反应，分析特定部位GRN的特征。
本文是采用水和甜味刺激野生型果蝇的翅膀，观察口器是否伸缩，以此来判断翅膀上是否存在可介导果蝇的进食行为糖类受体。
1.4.2 实验方法
实验所用为野生型果蝇。实验前，挑选1-2日龄雌蝇，在有充足水的条件下，饥饿24h。24h后，用冰将麻醉。挑出腹部干瘪、个大、健壮的果蝇，剪去腿，再将果蝇背部固定于银丝的一端。
依次用干燥、蘸有水、甜味混合刺激物（Mixture, 0.5M sucrose, 0.5M glucose, 0.5M fructose,0.5M trehalose）的纸条刺激翅膀的外侧缘，观察口器伸缩长度，再用0.1M sucrose刺激唇瓣，观察口器伸缩长度，并参考1965年Dethier等人[13]的评估方式打分。此操作连续重复三次。
图1 味觉行为学实验，10×
Figure1. proboscis extension reflex，10×
左：将饥饿的果蝇固定在蘸有胶水的银丝末端；右：用蘸有水或糖水的小纸条刺激翅膀外缘 Left: fix the starving fly in the end of the silver, which has been dipped in specific glue; Right: stimulate wing with a slip, which has been dipped in water or sugar solution
1.4.3 实验数据的处理
若用干燥纸条刺激果蝇，出现口器伸缩反应，则该果蝇排除统计范畴。
若用0.1M sucrose刺激唇瓣无反应，则该果蝇可能死亡或活性不佳，亦排除统计范畴。
同一只果蝇重复三次试验，其中只要出现一次口器伸缩反应，则纳入统计范畴。
若只有用0.1M sucrose刺激唇瓣才出现口器伸缩反应，统计时认为无效数据，记为“-”
若用水或Mixture刺激翅膀有口器伸缩反应，不论反应剧烈程度，统计时均认为有效数据，记为“+”。
2 结果与分析
黒腹果蝇体内共表达68种Grs，本文构建了其中34种Grs的表达图谱。这34种Grs为：Gr2a, Gr5a, Gr8a, Gr10a, Gr21a, Gr22a, Gr22b, Gr22c, Gr22d, Gr28a, Gr28ba, Gr28bb, Gr28bc, Gr28bd, Gr28be, Gr39aa, Gr39ad, Gr43a, Gr47a, Gr58a, Gr59d, Gr61a, Gr63a, Gr64e, Gr64f, Gr77a, Gr85a, Gr89a, Gr92a, Gr93c, Gr93d, Gr94a, Gr98b,Gr98c，均位于第二条染色体。
2.1 34种Grs的表达图谱
利用GAL4/UAS系统成功构建了34种Gr-GFP果蝇。将这34种果蝇解剖，把每种果蝇的唇瓣(labellum), 触须(antenna), 脑(brain), 腿(leg), 翅膀(wing), 以及生殖器(genitor)制成标本，进行荧光检测，记录，得到统计结果见表2.
表2 34种Grs在果蝇各器官的分布
Table2 The expression of 34 kinds of Grs in drosophila’s different organs
Organs Labellum Antenna Brain Leg Wing Genitor Male Female
Gr2a + - + - - - +
Gr5a + - + + - + +
Gr8a + - + + - + -
Gr10a - - - - - - -
Gr21a + + + - - - -
Gr22a - - - + - - -
Gr22b + - + + - - -
Gr22c + - + + - - -
Gr22d + - - - - - -
Gr28a + - + - - - -
Gr28ba + - + + - + -
Gr28bb + + + + + - -
Gr28bc + - + + + - +
Gr28bd + + （arista+） + + + + +
Gr28be + - + + - + -
Gr39aa + - + - - - -
Gr39ad + - + - - + -
Gr43a + - + + - - -
Gr47a + - - - - - -
Gr58a - - - - - + +
Gr59d + - + + - + -
Gr61a + - + + - + -
Gr63a - + + - - + -
Gr64e + - + + + + -
Gr64f + + + + - - -
Gr77a + - + - - - -
Gr85a + - - - - - -
Gr89a + - + + + - -
Gr92a + - + - - - +
Gr93c + - - - - - +
Gr93d + - + - - + +
Gr94a - - - - - - -
Gr98b + - + - - - -
Gr98c + + + - - - +
“+”：在该部位检测到有特定Gr表达；“-”：在该部位未检测到特定Gr表达 “+”: Specific Gr expression was detected in this organ;“-”: No specific Gr expression was detected in this organ
由表2可见，果蝇同一部位有多种Grs表达，而同一种Gr也可表达在果蝇的多个部位。
2.1.1 Grs在唇瓣的分布
唇瓣是果蝇最主要的味觉器官，其上有大量的Grs分布，在统计的34种Grs种，有29种在唇瓣上表达。在荧光检测中观察发现，不同Grs标记的GRN的数量存在较大差异，故对特定Grs标记的GRN数量进行详细统计，得到结果见表3。
表3 34种Grs标记的GRNs在唇瓣中表达量
Table3 The expression number of GRNs marked by 34 kinds of Grs in the labellum
Neuron NumberKinds of Grs
010a,22a,58a,63a,94a
1~52a,21a,28a,28bc,28bd,47a,77a,85a,92a,93c,93d,98c,98b,22c,22d
6~108a,22b,28be,39ad,43a,59d,61a
>105a,28ba,64e,64f,89a
由表3可知，有5种Grs（5a,28ba,64e,64f,89a）在唇瓣上大量表达。唇瓣是果蝇用来摄取食物的器官，这些Grs在唇瓣上大量表达提示着它们在味觉的识别中作用很大。已有文献报道，Gr5a是海藻糖的受体，在甜味的识别中起来至关重要的作用，为糖神经元表面的标志性受体[14]。下图为Gr5a在果蝇唇瓣中的表达图谱。
图2 Gr5a在果蝇唇瓣中的表达图谱
Figure2 the expression pattern of Gr5a in the labellum
左图10X；右图60X Left 10X; Right 60X
由图2可见，唇瓣上绝大部分的神经元都表达Gr5a。本实验结果中，发现存在其它Grs在唇瓣中的表达图谱和Gr5a表达图谱很像，如Gr64f、Gr61a等。我们猜测可能和Gr5a有共定位。因Gr5a是识别甜味的受体，和Gr5a有共定位作用的Grs很有可能也起了识别甜味的作用。下图为Gr64f在果蝇唇瓣中的表达图谱。
图3 Gr64f在果蝇唇瓣中的表达图谱
Figure3 the expression pattern of Gr64f in the labellum
左图10X；白色刻度线：50μm Left 10X: White bar: 50μm
除了一些和Gr5a表达类似的Grs外，还有很多是单独表达的，猜测这些Grs可能起了识别其他味觉的作用，比如苦味，酸味，咸味等。这些都有待我们去研究发现。
2.1.2 Grs在触须的分布
触须是果蝇重要的嗅觉器官，表面分布着3种不同形态的sensilla[15]。气味分子通过sensilla上广泛分布的小孔进入，与嗅觉神经元表面的受体接触，从而感知气味。猜测分布在触须上的6种Grs：Gr21a, Gr28bb, Gr28bd, Gr63a, Gr64f, Gr98c，其作用可能不是感受味道分子，而是与嗅觉受体类似，感受气味分子。已有报道称Gr21a,Gr63a共异位表达在非CO2敏感的嗅觉神经元中，用于感受CO2浓度变化[16]。
图4 Gr21a(上)，Gr28bd（下）在果蝇触角中的表达图谱
Figure4 the expression pattern of Gr21a(above), Gr28bd(below) in the antenna
左图10X；右图60X Left 10X; Right 60X
由图4、5可见，Gr28bd不仅表达在触须上，触须芒(arista)上也有表达。图5中，Gr28bd表达在触须芒基部及柄部，这与2013年Ni L.等人报道的Gr28bd表达部位一致，他们发现Gr28bd表达在该部位热神经元上，感受迅速变化的环境温度[17]。当温度快速升高时，使果蝇产生迅速行为反应。
图5 Gr28bd在果蝇触须芒的表达图谱
Figure5 the expression pattern of Gr28bd in the arista
左图10X；白色刻度线：20μm Left 10X; White bar: 20μm
2.1.3 Grs在脑的分布
由表2可见，有26种Grs在大脑中表达。大部分Grs在脑中的作用我们并不清楚。其中，有报道称，Gr43a是果糖受体，在脑中具有营养传感器的功能。它不但能感受血糖中的果糖浓度，而且还能调节果蝇的进食行为。当果蝇饥饿时，促进果蝇进食；反之，抑制其进食[18]。由此，猜测其余表达在脑中的Grs可能有同Gr43a类似的功能，能够与内源性物质结合，从而调控果蝇行为。这些有待我们进一步研究。
图6 Gr28bd（左）、Gr28bc（中）、Gr43a（右）在果蝇大脑中的表达图谱
Figure6 the expression pattern of Gr28bd(left), Gr28bc(media), Gr43a（right）in the brain
上图10X；下图60X Above10X; Below 60X
2.1.4 Grs在腿的分布
腿是果蝇另一个重要的味觉器官，跗趾是感受味觉的主要部位，其上分布着大量sensilla。当果蝇着落在食物上时，跗趾上的sensilla通过接触食物，感受到食物的味道。与唇瓣的Grs分布情况相比，发现16种分布在腿上的Grs中有15种同时也分布在唇瓣上，这表明果蝇用腿就能识别较多的味道。在前腿，雄性有50个sensilla，而雌性只有37个。在雌雄交配时，会出现雄性用前腿拍雌性腹部的有趣现象。有报道称，这些雄性特异性的sensilla可能是用于识别雌性发出的信息素[19]。这一信息提示，表达在腿上的Grs不仅能感受味道分子，还可能识别信息素。
图7 Gr61a在果蝇腿中的表达图谱
Figure7 the expression pattern of Gr61a in the leg
左图10X；右图60X Left 10X; Right 60X
2.1.5 Grs在翅膀的分布
有关Gr的文献中都会提到翅膀边缘有味觉感器分布，然而至今未有文献揭示果蝇翅膀外源Gr的功能。本实验结果表明，有4种Grs：Gr28bd,Gr8bb,Gr28bc,Gr64e表达在翅膀的外缘上。果蝇在果树间飞翔时，翅膀可能会感受到某些分子，吸引果蝇过去吃水果，猜测这些Grs可能具有识别味道的功能。然而，本文发现Grs的表达部位并不局限于翅膀外缘，还表达在翅膀中间，如图8所示，Gr89a表达在第三翅脉上。猜测Gr89a可能起了其他作用。
图8 Gr28bb在果蝇翅膀中的表达图谱
Figure8 the expression pattern of Gr28bb in the wing
左图10X；右图60X Left 10X; Right 60X
图9 Gr89a在果蝇翅膀中的表达图谱
Figure9 the expression pattern of Gr89a in the wing
左图10X；白色刻度线：20μm Left 10X; White bar: 20μm
2.1.6 Grs在生殖器的分布
由表2可见，生殖器上的Grs分布具有性别特异性。Gr5a,Gr28bd,Gr58a,Gr93d在雌雄体中均有表达，猜测它们参与异性识别的可能性较小。雄性特异性表达的Grs可能在交配中发挥作用，感受异性发出的吸引性信息素以及同性发出抑制性信息素。而雌性特异性Grs可能与产卵行为有关，雌性果蝇在产卵时需要找到营养丰富的环境，提高后代的存活率。
图10 Gr28bd（上），Gr28bc（下）在雌蝇生殖器中的表达图谱
Figure10 the expression pattern of Gr28bd(above), Gr28bc(below) in the female genitor
左图10X；右图60X Left 10X; Right 60X
图11 Gr64f（上），Gr28bd（下）在雄蝇生殖器中的表达图谱
Figure11 the expression pattern of Gr64f（above），Gr28bd（below）in the male genitor
左图10X；右图60X Left 10X; Right 60X
2.2 味觉行为学实验结果
目前还没有关于翅膀上Gr的报道，而我的实验结果发现在翅膀上有Gr的表达。若能阐释果蝇翅膀上的味觉受体的功能，这将是果蝇味觉研究领域中比较重要的突破。
以野生型雌性果蝇作为实验对象，共进行6组实验，每组果蝇19-24只，统计得到如下结果：
表4. 水、糖水混合物刺激果蝇翅膀的NIPER值
NIPER W-S+ W+S+ W-/+S+
NO.1 15.7% 36.8% 52.6%
NO.2 9.0% 40.1% 49.1%
NO.3 9.5% 28.5% 38.1%
NO.4 10.5% 42.1% 52.6%
NO.5 13.0% 47.8% 60.8%
NO.6 13.0% 34.7% 47.8%
Mean 11.8% 38.3% 50.1%
“W” water, “S” sugar mixture; NIPER= NPER/ Ntota “+”刺激后出现口器伸长; ”-”刺激后未出现口器伸长 “+”proboscis extended after stimulus; “-” proboscis didn’t extend after stimulus
由表4可见，实验中Mixture刺激出现口器伸长（W-/+S+）的NIPER为50.1%，其中先后用水、Mixture刺激均有口器伸长（W+S+）的NIPER为38.3%，先用水刺激无反应后用Mixture刺激出现口器伸长（W-S+）的NIPER为11.8%。因为Mixture中包含了糖分子和水分子，而典型的sensilla中有四种神经元：甜味神经元、苦味神经元、水神经元和盐神经元，为排除因为Mixture刺激水神经而引起伸缩反应的可能，故在实验中先用水刺激翅膀。可以看到用水刺激未产生反应时再用Mixture刺激口器可出现伸长现象，这证明翅膀上存在糖类受体，并且能介导果蝇的进食行为。同时，水刺激翅膀也会出现口器伸缩反应，这说明翅膀上也存在水神经元。但实验中并不是所有果蝇都出现反应，这可能跟刺激的部位有关，当用蘸有Mixture小纸条去刺激翅膀时，不能保证特定GRN所在sensilla每次都能与Mixture中的糖分子接触。
3 讨论
哺乳动物只有唯一的味觉感受器官——舌头，而果蝇的味觉系统远比其复杂。果蝇有68种味觉受体，唇瓣、翅缘、生殖器官和跗趾上均表达分布。同一部位可有多种Grs表达，而同一种Gr也可表达在多个部位。这些都增加了研究果蝇味觉受体的难度。
目前部分Grs的功能研究已有一些进展。Gr5a是果蝇Gr家族中分布最广泛的Gr受体，主要感受trehalose，是糖神经元中的标志性受体。Gr66a在唇瓣的短型、中间型sensilla中均有表达，是感受咖啡因的受体，同时也是苦味神经元的标志性受体[20]。此外，发现Grs不仅表达在GRN上，还能表达在其它与味觉无关的神经元或组织中。Gr21a,Gr63a共异位表达在非CO2敏感的嗅觉神经元中，感受CO2浓度变化。Gr28bd表达在热神经元上，感受迅速变化的环境温度。尽管如此，大部分Grs的功能仍是未知。
本文通过遗传学和行为学实验，研究果蝇味觉受体的表达分布及其功能。利用绿色荧光蛋白标记表达特定味觉受体的神经元，通过荧光检测确定了34种味觉受体的表达分布，并通过果蝇味觉行为学实验证明翅膀上存在糖类受体，并且可以介导果蝇的进食行为。研究成果具有十分重要的意义，首先，它是阐明GRN受体接受外界信号至将信息传递到大脑，从而使昆虫对外界信号作出行为反应的基础理论，其次，Grs功能的研究能够应用到生产实践，如敲除或沉默控制雌蝇产卵行为的Grs，能使果蝇的繁殖率大大降低，从而应用于控制虫害，实现保护人类健康和减少农业损失。
可从多个方面展开下一步的研究。第一，是分布在翅膀上的Grs功能的研究。本文结果确定了在翅膀上有Gr28bd,Gr8bb,Gr28bc,Gr64e表达，且能够感受糖类、介导果蝇的进食行为。但具体是哪个或哪些味觉受体在发挥作用我们并不知道。在下一步的研究中，可利用钙成像技术，通过观察钙离子介导的信号传递过程[21]，确定与糖类分子识别相关的Gr。此外，本文发现存在分布在翅中的Gr89a，其功能可能与识别味道无关，对它的研究思维应不局限在味觉领域。
第二，分布在触角上的Grs功能的研究。本文发现Gr21a, Gr28bb, Gr28bd, Gr63a, Gr64f, Gr98c在果蝇的嗅觉器官触角上表达分布。猜测它们功能可能与嗅觉受体类似，对于它们的研究可利用嗅觉系统较成熟的研究方法。
第三，是对于已知功能Gr的味觉信号传导机制的研究。目前，虽然已经知道了一些Grs的功能，但Gr与味道分子结合后如何产生信号分子并进行信号传递以及中枢神经系统对信号加工最终调控昆虫行为的分子机制，大家仍不清楚。利用电生理技术用不同味道的物质刺激特异性表达某种Gr的sensilla，记录sensilla内GRN的电生理活动，根据电生理变化曲线推测味觉系统的传导机制。
此外，作为味觉受体家族的一员——Gr10a未表达分布在成年果蝇的任何部位。因为果蝇变态发育过程中幼虫和成虫的形态差异较大，根据用进废退理论，可能Gr10a在幼虫上有表达且具有一定功能但成虫后不再需要此功能所以Gr10a未表达。可以尝试在果蝇幼虫上寻找Gr10a的表达分布。
致谢
在北京大学做毕业论文的这三个多月的时光中，我深深地被实验室良好的科研氛围所打动，收获颇丰，这段时光已成为我人生中的一笔宝贵的财富，我会牢记这段时光。在此，我衷心地感谢给过我帮助和鼓励的每一个人。
非常感谢我的另一个导师——大学的张源淑教授，谢谢您这五年来对我学习生活的关心，谢谢您允许我到北京大学做毕业论文并且时时关心我的实验进展。您对学生总是那么和蔼可亲，祝您今后工作和生活一切顺心！
感谢我的家人，感谢他们对我的养育之恩，感谢他们对于我多年的教育培养。
最后，感谢各位评委在百忙之中抽空认真审阅我的论文！
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1果蝇饲养2
1.1.1果蝇生活史2
1.1.2 饲养条件2
1.1.3 培养基的配制2
1.1.4 果蝇辨别与收集3
1.1.5 果蝇的传代培养3
1.2 构建Gr-GFP果蝇3
1.2.1 GAL4/UAS系统简介3
1.2.2果蝇遗传学基础3
1.2.2 Gr-GFP果蝇的构建方法4
1.3检测Grs的表达部位4
1.3.1 果蝇各器官的解剖4
1.3.2 荧光检测4
1.4 味觉行为学实验（PER）5
1.4.1实验原理5
1.4.2 实验方法5
1.4.3 实验数据的处理5
2 结果与分析6
2.1 34种Grs的表达图谱6
2.1.1Grs在唇瓣的分布7
2.1.2 Grs在触角的分布8
2.1.3 Grs在脑的分布9
2.1.4 Grs在腿的分布9
2.1.5 Grs在翅膀的分布10
2.1.6 Grs在生殖器的分布11
2.2 味觉行为学实验结果11
3 讨论12
致谢12
参考文献13
果蝇味觉受体的分布及功能
引言
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