野生水禽禽流感的荧光rtpcr监测
禽流感由甲型禽流感病毒引起可感染人和多种动物。野生水禽是禽流感病毒的天然贮存宿主，可在季节性迁徙过程中将病毒全球性扩散，给家禽养殖业和人类的健康安全带来极大的隐患。荧光RT-PCR特异性强、灵敏度高，已广泛应用于多种疾病的诊断。本试验对江苏省徐州、淮安盱眙、南京汤山3个采样地的8种野生水禽，共214份泄殖腔拭子和新鲜粪便样品，进行荧光RT-PCR检测，将检测阳性样品接种于SPF鸡胚分离病毒。结果显示，其中19个样品检测结果为阳性，病毒阳性率为8.87 %(19/214)，病毒分离率为5.61 %（12/214）。本文将本试验数据与数年来的研究数据进行比较，为本地区禽流感疫情的预防起到了一定的借鉴作用。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1．1．1 样品采集及处理 2
1．1．2 主要试剂 3
1．1．3 主要仪器设备 3
1．2 方法 3
1．2．1 病毒核酸提取 3
1．2．1．1 裂解液的准备 3
1．2．1．2 清洗核酸纯化柱 3
1．2．1．3 洗脱RNA 3
1．2．2 荧光RTPCR检测禽流感病毒 3
1．2．3 病毒的分离与增殖 4
1．2．4 血凝试验 4
2 结果与分析 4
2．1 荧光RTPCR检测禽流感病毒结果 4
2．1．1 质量控制标准及结果判断 4
2．1．2 样品检测结果 5
2．2 病毒分离结果 7
3 讨论 7
致谢 8
参考文献： 9
江苏省野生水禽禽流感的荧光RTPCR监测
引言
禽流感(Avian influenza，AI)，又称真性鸡瘟，由正黏病毒科(Orthomyxoviridae)、甲型流感病毒属(Influenza virus A)中的禽流感病毒(Avian influenza v
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
irus，AIV)引起的一种禽类（家禽和野禽）的烈性病毒性传染病[1]，几乎一年四季在所有的家养及野生禽类中都会发生[2]。根据AIV对鸡和火鸡的毒力不同可将其分为高致病性(HPAI)、低致病性(LPAI)和非致病性禽流感(NPAI)三大类，其中HPAI具有高发病率和高死亡率，在我国属一类动物疫病[3,4]。自1878年首次报道以来，全球各地陆续有禽流感疫情的爆发，并不断出现人感染禽流感事件，造成了各国经济严重的损失[5,6]。因此，禽流感己成为具有非常重要的公共卫生学意义的流行性传染病，引起了全世界各卫生组织的广泛关注。
禽流感病毒的核酸为线状单股的负链RNA，基因组共分为8个独立节段，分别编码病毒的神经氨酸酶（neuraminidase，NA）、囊膜糖蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）、基质蛋白（matrix protein，M1、M2）、依赖RAN的RNA聚合酶（PB1、PB2、PA）、核蛋白（nucleoprotein，NP）和非结构蛋白（nonstructural protein，NSl、NS2）[7,8,9]。HA和NA具有亚型及株的特异性，目前已鉴别出16种不同的HA（H1~H16）和10种不同的NA（N1~N9），可将两者任意组合成为一个亚型，如H1N1、H3N2等共135种亚型[10,11,12]。迄今发现的全部的HA和NA亚型组合在禽类中都能找到。研究发现野生水禽分离到禽流感病毒的几率远高于其他禽类，且分离到的数目和种类也更多，可见野生水禽中存在庞大的甲型流感病毒库[13]。基因遗传进化研究显示，野生水禽流感病毒的进化率低，但病毒核酸以与哺乳动物相近的速率突变，充分表明了未来流行于人类的流感病毒的基因表型仍继续的贮存于水禽流感病毒基因库中[14,15,16]。
华东地区是我国流感的流行中心，流感病毒常年存在于这一区域，稠密的人口和大量的水禽养殖有利于流感病毒在这一地区更好的进化与传播，具有极大的流感疫情爆发的风险。是以，有必要加强对该地域的禽流感病毒的分布和传播情况进行监测。其中，江苏省地跨淮河和长江南北，地势平坦，湖泊较多，水域面积广阔是野生水禽理想栖息之地，主要有绿头鸭、绿翅鸭、斑嘴鸭、赤麻鸭、黑天鹅、大雁、斑头雁等数目众多雁鸭类。江苏省是我国水禽养殖业最为发达地区之一，极大可能的使野生水禽与家养水禽在同一片水域近距离直接接触，更有利于将流感病毒从野生水禽传播给家养水禽，对畜牧业发展和人类的健康安全均存在了极大的隐患。
禽流感病毒的确诊主要是基于病毒的分离和鉴定、病毒血清学和分子生物学诊断等方面[17]。RTPCR可精确的检测和鉴别极其微量的特异性的核酸，以RTPCR为基础的各种检测和诊断方法已成为世界各国研究AIV检测技术的热点之一[18,19]。荧光RTPCR是目前检测样品中DNA(或cDNA)最敏感、最准确的方法之一。
本试验采用荧光RTPCR方法，对从江苏省徐州、汤山、盱眙等地采集的8种野生水禽泄殖腔拭子和新鲜粪便，共计214份样品，进行甲型流感病毒的检测，以调查江苏省境内野生水禽禽流感病毒的携带情况，为江苏省野生水禽禽流感病毒的监测和流感病毒基础研究提供重要参考信息。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 样品采集及处理 2015年09月2015年11月于江苏省境内的徐州、汤山、盱眙等地内采集8种野生水禽泄殖腔拭子和新鲜粪便共计214份，将样品放入含有3 mL病毒维持液的无菌采样管中，旋紧管盖并密封，低温快速送往实验室处理：混匀样品，离心后取上清液，冻存于20 ℃备用。具体采样信息见表11，12，13。
表11 徐州野生水禽采样信息
Table 11 The information of the samples of wild waterfowl collected in Xuzhou
野生水禽种类
拉丁文名称
数量(只)
时间/采样地点
斑头雁
Anser indicus
26
2015.09 /徐州
鸿雁
Anser cygnoides
23
2015.09 /徐州
疣鼻天鹅
Cygnus olor
13
2015.09 /徐州
黑天鹅
Cygnus atratus
27
2015.09 /徐州
赤麻鸭
Tadorna ferruginea
26
2015.09 /徐州
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1．1．1 样品采集及处理 2
1．1．2 主要试剂 3
1．1．3 主要仪器设备 3
1．2 方法 3
1．2．1 病毒核酸提取 3
1．2．1．1 裂解液的准备 3
1．2．1．2 清洗核酸纯化柱 3
1．2．1．3 洗脱RNA 3
1．2．2 荧光RTPCR检测禽流感病毒 3
1．2．3 病毒的分离与增殖 4
1．2．4 血凝试验 4
2 结果与分析 4
2．1 荧光RTPCR检测禽流感病毒结果 4
2．1．1 质量控制标准及结果判断 4
2．1．2 样品检测结果 5
2．2 病毒分离结果 7
3 讨论 7
致谢 8
参考文献： 9
江苏省野生水禽禽流感的荧光RTPCR监测
引言
禽流感(Avian influenza，AI)，又称真性鸡瘟，由正黏病毒科(Orthomyxoviridae)、甲型流感病毒属(Influenza virus A)中的禽流感病毒(Avian influenza v
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
irus，AIV)引起的一种禽类（家禽和野禽）的烈性病毒性传染病[1]，几乎一年四季在所有的家养及野生禽类中都会发生[2]。根据AIV对鸡和火鸡的毒力不同可将其分为高致病性(HPAI)、低致病性(LPAI)和非致病性禽流感(NPAI)三大类，其中HPAI具有高发病率和高死亡率，在我国属一类动物疫病[3,4]。自1878年首次报道以来，全球各地陆续有禽流感疫情的爆发，并不断出现人感染禽流感事件，造成了各国经济严重的损失[5,6]。因此，禽流感己成为具有非常重要的公共卫生学意义的流行性传染病，引起了全世界各卫生组织的广泛关注。
禽流感病毒的核酸为线状单股的负链RNA，基因组共分为8个独立节段，分别编码病毒的神经氨酸酶（neuraminidase，NA）、囊膜糖蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）、基质蛋白（matrix protein，M1、M2）、依赖RAN的RNA聚合酶（PB1、PB2、PA）、核蛋白（nucleoprotein，NP）和非结构蛋白（nonstructural protein，NSl、NS2）[7,8,9]。HA和NA具有亚型及株的特异性，目前已鉴别出16种不同的HA（H1~H16）和10种不同的NA（N1~N9），可将两者任意组合成为一个亚型，如H1N1、H3N2等共135种亚型[10,11,12]。迄今发现的全部的HA和NA亚型组合在禽类中都能找到。研究发现野生水禽分离到禽流感病毒的几率远高于其他禽类，且分离到的数目和种类也更多，可见野生水禽中存在庞大的甲型流感病毒库[13]。基因遗传进化研究显示，野生水禽流感病毒的进化率低，但病毒核酸以与哺乳动物相近的速率突变，充分表明了未来流行于人类的流感病毒的基因表型仍继续的贮存于水禽流感病毒基因库中[14,15,16]。
华东地区是我国流感的流行中心，流感病毒常年存在于这一区域，稠密的人口和大量的水禽养殖有利于流感病毒在这一地区更好的进化与传播，具有极大的流感疫情爆发的风险。是以，有必要加强对该地域的禽流感病毒的分布和传播情况进行监测。其中，江苏省地跨淮河和长江南北，地势平坦，湖泊较多，水域面积广阔是野生水禽理想栖息之地，主要有绿头鸭、绿翅鸭、斑嘴鸭、赤麻鸭、黑天鹅、大雁、斑头雁等数目众多雁鸭类。江苏省是我国水禽养殖业最为发达地区之一，极大可能的使野生水禽与家养水禽在同一片水域近距离直接接触，更有利于将流感病毒从野生水禽传播给家养水禽，对畜牧业发展和人类的健康安全均存在了极大的隐患。
禽流感病毒的确诊主要是基于病毒的分离和鉴定、病毒血清学和分子生物学诊断等方面[17]。RTPCR可精确的检测和鉴别极其微量的特异性的核酸，以RTPCR为基础的各种检测和诊断方法已成为世界各国研究AIV检测技术的热点之一[18,19]。荧光RTPCR是目前检测样品中DNA(或cDNA)最敏感、最准确的方法之一。
本试验采用荧光RTPCR方法，对从江苏省徐州、汤山、盱眙等地采集的8种野生水禽泄殖腔拭子和新鲜粪便，共计214份样品，进行甲型流感病毒的检测，以调查江苏省境内野生水禽禽流感病毒的携带情况，为江苏省野生水禽禽流感病毒的监测和流感病毒基础研究提供重要参考信息。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 样品采集及处理 2015年09月2015年11月于江苏省境内的徐州、汤山、盱眙等地内采集8种野生水禽泄殖腔拭子和新鲜粪便共计214份，将样品放入含有3 mL病毒维持液的无菌采样管中，旋紧管盖并密封，低温快速送往实验室处理：混匀样品，离心后取上清液，冻存于20 ℃备用。具体采样信息见表11，12，13。
表11 徐州野生水禽采样信息
Table 11 The information of the samples of wild waterfowl collected in Xuzhou
野生水禽种类
拉丁文名称
数量(只)
时间/采样地点
斑头雁
Anser indicus
26
2015.09 /徐州
鸿雁
Anser cygnoides
23
2015.09 /徐州
疣鼻天鹅
Cygnus olor
13
2015.09 /徐州
黑天鹅
Cygnus atratus
27
2015.09 /徐州
赤麻鸭
Tadorna ferruginea
26
2015.09 /徐州
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