肥胖症对小鼠卵母细胞表观修饰的影响
肥胖症是导致雌性不孕不育的重要因素之一，而雌性肥胖症主要影响卵母细胞的数量、卵母细胞的成熟和受精能力。先前的研究证明肥胖症可能是通过对荷尔蒙含量和脂肪因子的调节来影响卵母细胞成熟，但是到目前为止肥胖症影响卵母细胞成熟和胚胎发育的机制了解的并不多。本实验从表观遗传学方面，以诱导性肥胖小鼠和突变体缺陷型肥胖症小鼠作为模型，通过免疫荧光技术检测DNA甲基化和组蛋白甲基化水平的变化，研究了普通小鼠与两种肥胖小鼠（HFD和ob/ob）GV期卵母细胞的几种表观遗传修饰。结果表明,与普通小鼠相比，两种肥胖小鼠GV期卵母细胞DNA甲基化5-甲基胞嘧啶(5mC)、组蛋白H3K27-me2、H3K9-me2都发生了不同程度的变化。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1实验材料2
1.1实验对象与试剂 2
1.2试剂的配制 2
1.3实验仪器与设备3
2实验方法3
2.1实验流程3
2.2实验步骤4
2.2.1模型构建4
2.2.2卵母细胞收集4
2.2.3卵母细胞间接荧光染色4
2.2.3.1间接荧光染色步骤4
2.2.3.2抗体选择4
2.2.4激光共聚焦扫描5
2.2.5荧光强度统计5
3结果与分析 5
3.1模型构建成功 5
3.2小鼠GV期卵母细胞DNA甲基化marker蛋白5mC的荧光表达 5
3.3小鼠GV期卵母细胞组蛋白甲基化marker蛋白H3K27的荧光表达 6
3.4小鼠GV期卵母细胞组蛋白甲基化marker蛋白H3K9的荧光表达 6
4讨论7
致谢8
参考文献8
肥胖症对小鼠卵母细胞表观修饰的影响
引言
引言
肥胖症(Obesity)是一种当前社会常见的慢性疾病，在世界范围内发病率一直处于上升趋势。一般情况下，过量的能量摄入和静止型的生活方式是导致肥胖症的两大主要原因。肥胖症可以导致多种心 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
理和生理疾病，例如糖尿病、癌症、脂肪肝、心血管疾病以及生殖疾病等[1]。近几年，肥胖严重影响人们生活质量,威胁患者生命健康,越来越多的人遭受肥胖症的困扰，肥胖症已经成为全世界拟解决的难题之一，因此也越来越引起人们的关注。
对于女性，肥胖还可引起性激素紊乱、停止排卵、月经失调、不孕等,甚至引起肿瘤和癌变,如子宫内膜癌等[2]。相关研究证明，雌性肥胖症主要影响卵母细胞的数量、卵母细胞的成熟和受精能力。众所周知，对于受精的成功和后期胚胎早期的发育而言，卵母细胞成熟质量是十分重要的，卵母细胞质量的下降可以直接引起受精失败、多精受精等情况的发生，而这种卵母细胞质量的下降往往来源于卵母细胞成熟的异常，而肥胖症能够导致低质量卵母细胞的上升、受精失败，并直接影响到后期的胚胎发育与着床。
尽管大量的实验和临床报告证明肥胖症能够影响卵子的质量，但是大部分研究只是集中在肥胖症导致的激素水平异常这一方面，而肥胖症最终影响了卵子质量的哪个方面并不清楚、肥胖症个体的卵子质量下降的指标还一直有欠缺，并且，肥胖症是如何影响卵母细胞成熟和胚胎发育的，其分子机制目前尚且不是很清楚。
基因的序列不发生变化，而基因表达发生改变，也可以在细胞发育和细胞增殖过程中稳定遗传下去，从而引起可以遗传的表现型变化，这种表现型变化因为没有直接涉及基因的序列信息，而是“表观”的，所以称之为表观遗传变异，又叫表观遗传修饰[3]。值得注意的是，表观遗传修饰是可逆的[4]。
甲基化是表观遗传修饰的一个重要修饰，它包含了DNA甲基化以及组蛋白甲基化，是蛋白质和核酸的一种重要的修饰[5]。例如，研究表明，5mC的水平与与细胞的代谢和增殖有密切的关系，Ｈ3Ｋ9和Ｈ3Ｋ27甲基化与基因转录抑制有密切的关系。
近年来，科学家们对于疾病（包括肥胖）的表观遗传做了很多研究，表明一些内在或外在的因素确实能够通过影响表观遗传修饰造成机体病理上的变化。在卵子的生成过程中，经历着复杂深刻的表观遗传修饰，我们可以猜想：是否肥胖症可引起雌性动物卵子的表观修饰发生改变，从而影响了卵子的成熟，导致的卵母细胞质量下降，引起受精失败，造成进而对其生殖力造成影响。我们可以通过免疫荧光技术检测DNA甲基化和组蛋白甲基化水平的变化，深入研究肥胖症在表观修饰方面对小鼠卵母细胞的影响，深入了解肥胖症影响卵母细胞质量的原因，为探索并筛选肥胖症人群的生殖健康治疗药物提供理论基础和支持。
实验材料
1.1实验对象与试剂
C57BL6品系雌性小鼠，购自南京医科大学；B6.CgLepob/JNju品系雌性小鼠，购自南京大学；小鼠饲料MD12031（10 g/100 g fat）,高脂饲料MD12032（45g/100 g fat），购自 Mediscience 公司；孕马血清促性腺激素（PMSG）；鼠单克隆抗5mC抗体[5MCCD]，购自Abcam 公司(Cambridge, UK)；兔多克隆抗H3K9me2抗体，Upstate Chemicals公司 (Billerica, MA)；兔多克隆抗H3K27me2抗体，购自Cell Signaling Technology公司(Beverly, MA)；M16培养液；含4%多聚甲醛固定液；0.5%Triton X100透膜液；PBS封闭液；清洗缓冲液；荧光二抗Alexa Fluor488，荧光二抗Alexa Fluor568，购自Invitrogen公司 (Carlsbad, CA, USA)；核染料Hoechst3342，购自SigmaAldrich 公司(St. Louis, MO, USA)。
1.2试剂的配制
（1）4%多聚甲醛固定液：
试剂
使用量
多聚甲醛
40g
0.1mol/LPBS
500ml
混合后加热至60℃，搅拌并滴加1N NaOH至清亮为止，冷却后加PBS至总量1000ml
（2）0.5%Triton X100透膜液：
试剂
使用量
10%Triton X100
9.5ml
PBS
0.5ml
量取上述试剂，混匀，用0.22 μm滤器过滤，然后4℃冰箱保存备用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1实验材料2
1.1实验对象与试剂 2
1.2试剂的配制 2
1.3实验仪器与设备3
2实验方法3
2.1实验流程3
2.2实验步骤4
2.2.1模型构建4
2.2.2卵母细胞收集4
2.2.3卵母细胞间接荧光染色4
2.2.3.1间接荧光染色步骤4
2.2.3.2抗体选择4
2.2.4激光共聚焦扫描5
2.2.5荧光强度统计5
3结果与分析 5
3.1模型构建成功 5
3.2小鼠GV期卵母细胞DNA甲基化marker蛋白5mC的荧光表达 5
3.3小鼠GV期卵母细胞组蛋白甲基化marker蛋白H3K27的荧光表达 6
3.4小鼠GV期卵母细胞组蛋白甲基化marker蛋白H3K9的荧光表达 6
4讨论7
致谢8
参考文献8
肥胖症对小鼠卵母细胞表观修饰的影响
引言
引言
肥胖症(Obesity)是一种当前社会常见的慢性疾病，在世界范围内发病率一直处于上升趋势。一般情况下，过量的能量摄入和静止型的生活方式是导致肥胖症的两大主要原因。肥胖症可以导致多种心 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
理和生理疾病，例如糖尿病、癌症、脂肪肝、心血管疾病以及生殖疾病等[1]。近几年，肥胖严重影响人们生活质量,威胁患者生命健康,越来越多的人遭受肥胖症的困扰，肥胖症已经成为全世界拟解决的难题之一，因此也越来越引起人们的关注。
对于女性，肥胖还可引起性激素紊乱、停止排卵、月经失调、不孕等,甚至引起肿瘤和癌变,如子宫内膜癌等[2]。相关研究证明，雌性肥胖症主要影响卵母细胞的数量、卵母细胞的成熟和受精能力。众所周知，对于受精的成功和后期胚胎早期的发育而言，卵母细胞成熟质量是十分重要的，卵母细胞质量的下降可以直接引起受精失败、多精受精等情况的发生，而这种卵母细胞质量的下降往往来源于卵母细胞成熟的异常，而肥胖症能够导致低质量卵母细胞的上升、受精失败，并直接影响到后期的胚胎发育与着床。
尽管大量的实验和临床报告证明肥胖症能够影响卵子的质量，但是大部分研究只是集中在肥胖症导致的激素水平异常这一方面，而肥胖症最终影响了卵子质量的哪个方面并不清楚、肥胖症个体的卵子质量下降的指标还一直有欠缺，并且，肥胖症是如何影响卵母细胞成熟和胚胎发育的，其分子机制目前尚且不是很清楚。
基因的序列不发生变化，而基因表达发生改变，也可以在细胞发育和细胞增殖过程中稳定遗传下去，从而引起可以遗传的表现型变化，这种表现型变化因为没有直接涉及基因的序列信息，而是“表观”的，所以称之为表观遗传变异，又叫表观遗传修饰[3]。值得注意的是，表观遗传修饰是可逆的[4]。
甲基化是表观遗传修饰的一个重要修饰，它包含了DNA甲基化以及组蛋白甲基化，是蛋白质和核酸的一种重要的修饰[5]。例如，研究表明，5mC的水平与与细胞的代谢和增殖有密切的关系，Ｈ3Ｋ9和Ｈ3Ｋ27甲基化与基因转录抑制有密切的关系。
近年来，科学家们对于疾病（包括肥胖）的表观遗传做了很多研究，表明一些内在或外在的因素确实能够通过影响表观遗传修饰造成机体病理上的变化。在卵子的生成过程中，经历着复杂深刻的表观遗传修饰，我们可以猜想：是否肥胖症可引起雌性动物卵子的表观修饰发生改变，从而影响了卵子的成熟，导致的卵母细胞质量下降，引起受精失败，造成进而对其生殖力造成影响。我们可以通过免疫荧光技术检测DNA甲基化和组蛋白甲基化水平的变化，深入研究肥胖症在表观修饰方面对小鼠卵母细胞的影响，深入了解肥胖症影响卵母细胞质量的原因，为探索并筛选肥胖症人群的生殖健康治疗药物提供理论基础和支持。
实验材料
1.1实验对象与试剂
C57BL6品系雌性小鼠，购自南京医科大学；B6.CgLepob/JNju品系雌性小鼠，购自南京大学；小鼠饲料MD12031（10 g/100 g fat）,高脂饲料MD12032（45g/100 g fat），购自 Mediscience 公司；孕马血清促性腺激素（PMSG）；鼠单克隆抗5mC抗体[5MCCD]，购自Abcam 公司(Cambridge, UK)；兔多克隆抗H3K9me2抗体，Upstate Chemicals公司 (Billerica, MA)；兔多克隆抗H3K27me2抗体，购自Cell Signaling Technology公司(Beverly, MA)；M16培养液；含4%多聚甲醛固定液；0.5%Triton X100透膜液；PBS封闭液；清洗缓冲液；荧光二抗Alexa Fluor488，荧光二抗Alexa Fluor568，购自Invitrogen公司 (Carlsbad, CA, USA)；核染料Hoechst3342，购自SigmaAldrich 公司(St. Louis, MO, USA)。
1.2试剂的配制
（1）4%多聚甲醛固定液：
试剂
使用量
多聚甲醛
40g
0.1mol/LPBS
500ml
混合后加热至60℃，搅拌并滴加1N NaOH至清亮为止，冷却后加PBS至总量1000ml
（2）0.5%Triton X100透膜液：
试剂
使用量
10%Triton X100
9.5ml
PBS
0.5ml
量取上述试剂，混匀，用0.22 μm滤器过滤，然后4℃冰箱保存备用。
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