阿司匹林诱导hsp90表达抑制热应激心肌细胞凋亡的研究
：为了研究阿司匹林对鸡心肌细胞Hsp90表达的诱导作用及其对心肌细胞抗热应激凋亡能力的影响，本研究利用RT-PCR, Western blot, ELISA和TUNEL原位杂交等技术分别对饲喂阿司匹林后不同时间热应激处理的受试鸡心脏组织的HSF水平、hsp90 mRNA转录、Hsp90蛋白表达、抗凋亡关键蛋白Akt表达与激活、心肌细胞凋亡率等进行了动态研究。结果显示，热应激过程中，鸡心肌细胞内HSF-1的诱导与消耗、HSF-2和HSF-3的下调导致了hsp90 mRNA转录启动的推迟。而阿司匹林的饲喂不同程度地改变了HSF-1，2，3的表达水平，从而使鸡心肌细胞hsp90 mRNA在整个热应激过程中转录水平升高，进而诱导鸡心肌细胞Hsp90蛋白的提前高表达。热应激可导致鸡心肌细胞中hsp90 mRNA转录和Hsp90蛋白表达均出现明显延迟，从而抑制了Akt的表达与激活，导致鸡心肌细胞内caspase-3与caspase-9活性和心肌细胞热应激凋亡率显著升高。提前进行阿司匹林饲喂处理则可提前极显著上调hsp90 mRNA的基因转录（P<0.01）与其相应蛋白Hsp90的表达（2.3 - 4.1倍），进而Akt的表达与激活水平也相应提高，有效抑制了心肌细胞内caspase-3与caspase-9活性和心肌细胞热应激凋亡率（降低2.14 - 2.56倍）。表明提前对鸡进行阿司匹林饲喂可以通过显著提前诱导鸡心肌细胞中Hsp90表达，诱导并激活抗凋亡信号通路关键蛋白Akt，进而有效抑制其热应激凋亡。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 2
Key words 2
引言 3
1 材料与方法 3
1.1 试验材料 3
1.2 试验方法 4
1.3 数据分析 7
2 结果 7
2.1 阿司匹林对热应激状态下受试鸡临床表现的影响 7
2.2 阿司匹林对热应激处理鸡心肌细胞中HSF1，2，3，4表达量的影响 7
2.3 阿司匹林对热应激处理鸡心肌细胞内hsp90 mRNA转录水平的影响 8
2.4 阿司匹林对热应激处理鸡心肌细胞内Hsp90表达的影响 10
2
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
.5 阿司匹林对热应激处理鸡心肌细胞内Akt表达及其激活的影响 11
2.6 阿司匹林对热应激处理鸡心肌细胞内caspase3，8，9活性水平的影响 12
2.7 阿司匹林对热应激处理鸡心肌细胞凋亡率的影响 13
3 讨论 14
致谢 17
参考文献 18
附录A 主要试剂配制 20
附录B 本科期间发表论文 21
阿司匹林诱导Hsp90表达抑制热应激心肌细胞凋亡的研究
引言
应激反应是机体在受到内外各种不利因素的刺激时，出现的一种非特异性的全身反应，由于长时间、高强度的应激刺激，造成对机体严重病理损害，包括对重要组织器官（特别是心脏）的损伤、自身免疫力的减弱以及内环境稳态的破坏等[1,2,3]。热应激可以导致鸡生长速度的降低、鸡蛋孵化率降低、可引起母鸡性激素分泌失调而导致性成熟时间推移、产蛋量显著下降，甚至热应激可以造成鸡的突然死亡[4,5]。
然而，当暴露于应激环境时（如热应激），机体的组织细胞内会快速合成一系列特异性的、具有自我保护性的蛋白，即热休克蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs），其中HSP90家族是与心脏应激性保护作用较为密切的一个HSPs家族。Hsp90作为一种重要的分子伴侣，可用通过折叠、稳定的功能来调节许多细胞内蛋白的作用，使其在应激时保持有效的生物活性[6]；所以，Hsp90在细胞抵抗应激性损伤和凋亡过程中发挥着不可缺少的作用。Hsp90的应激性表达主要受热休克因子（Heat shock factors，HSFs）的调节，所有的HSF都具有相似的结构特点，具有保守性很强的DNA结合位点。应激刺激时，激活的HSF可进入细胞核内与热休克元件（Heat shock elements，HSE）结合而激发HSPs的表达[7]。
热应激还可以引起心肌细胞caspase3的活性升高，进而导致细胞的应激性凋亡[8]。细胞凋亡（Apoptosis）是机体组织应激性损伤的主要表现形式。热应激诱导的心肌细胞凋亡会引起心脏组织中成熟心肌细胞的大量丧失，进而导致心脏组织的缺血再灌注性损伤，最终引起动物的死亡[9]。而Hsps可以调节细胞应激性生存、凋亡和死亡[10]。
作为一种非甾类药物，阿司匹林可以通过降低机体对温度的敏感性阈值而发挥解热、镇痛作用[11]。近年来，阿司匹林在治疗心血管疾病中的临床应用越来越多，其对心肌细胞的作用引起了学者的广泛关注。本文在成功建立体外鸡心肌细胞热应激模型基础上，拟动态研究阿司匹林在热应激过程中对鸡心肌细胞内Hsp90表达水平的影响及其抵抗细胞热应激凋亡的作用，并从HSFs表达动力曲线等角度探讨阿司匹林在上述过程中的调控与保护机制，为阿司匹林在畜禽养殖中抗热应激损伤应用和探索Hsp90在鸡心肌细胞发挥应激保护作用的分子机制提供理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验器材 人工气候培养箱（隔离器，RXZ500D）为中国浙江宁波新江南机械有限公司产品；Real Time PCR（Stratagene Mx3000P）为美国安莱公司产品；精细匀浆机 (623003）为上海弗鲁克公司产品；iQ5 RT荧光定量PCR仪、蛋白质电泳仪（Power PacTM Basic）和冷光/生物发光影像分析仪（LAS4000）为美国BioRad公司产品；酶标仪（Infinite M200 pro）瑞士TECAN公司产品；高速离心机（Sorval Legend Micro 17R）为美国Thermo公司产品；低速离心机（LD42A）为北京京立离心机有限公司产品；电热恒温鼓风干燥箱（DHG9245A）和隔水式恒温培养箱（GHP9160）均为上海一恒科技公司产品；手压式薄膜封口机（SF200）为中国永康市喜尚工贸有限公司产品；制冰机（KB15A）为南京先欧科技有限公司产品；涡旋仪（QL901）为海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品；光学显微镜（AXio Cam HRC Imager A2）为德国ZEISS公司产品。电子秤（FA1004）为上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品。
1.1.2 主要试剂 阿司匹林（A2093100MG）购自美国Sigma公司；4%多聚甲醛溶液（AR0211）购自南京鼎国生物技术有限责任公司；RNA提取试剂盒TrizolRNAiso Plus reagent (D9108A）、2×混合荧光酶试剂SYBR Premix Ex Taq (DRR041S）购自大连宝生物公司；增强型HRPDAB底物显色试剂盒（PA110）购自北京天根生化科技有限公司；cDNA 反转录试剂盒 Transcript MMLV kit (28025013）购自美国Gibco公司；Hsp90 ELISA检测试剂盒（P17142998）为美国CUSABIO? 公司产品；Hsp90大鼠单克隆抗体（ADISPA840）购自美国Enzo Life Science公司；Akt单克隆抗体（9272S）购自美国CST公司；羊抗大鼠鼠辣根过氧化物酶二抗（HD00051）、BCA蛋白定量测定试剂盒（57200150）购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluorid，PMSF，E081）购自南京建成生物工程研究所；RIPA裂解液（50 mM Tris，pH 7.4，150 mM NaCl，1% NP40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS and l mL PMSF）购自美国Thermo公司。pAkt（DRE60152）、caspase3（DRE60223）、caspase8 （DRE60228）、caspase9（DRE60231）检测试剂盒均购自南京奥青生物技术有限公司；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（KGA7021）购自南京凯基生物科技发展有限公司。
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摘要 1
关键词 1
Abstract 2
Key words 2
引言 3
1 材料与方法 3
1.1 试验材料 3
1.2 试验方法 4
1.3 数据分析 7
2 结果 7
2.1 阿司匹林对热应激状态下受试鸡临床表现的影响 7
2.2 阿司匹林对热应激处理鸡心肌细胞中HSF1，2，3，4表达量的影响 7
2.3 阿司匹林对热应激处理鸡心肌细胞内hsp90 mRNA转录水平的影响 8
2.4 阿司匹林对热应激处理鸡心肌细胞内Hsp90表达的影响 10
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*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
.5 阿司匹林对热应激处理鸡心肌细胞内Akt表达及其激活的影响 11
2.6 阿司匹林对热应激处理鸡心肌细胞内caspase3，8，9活性水平的影响 12
2.7 阿司匹林对热应激处理鸡心肌细胞凋亡率的影响 13
3 讨论 14
致谢 17
参考文献 18
附录A 主要试剂配制 20
附录B 本科期间发表论文 21
阿司匹林诱导Hsp90表达抑制热应激心肌细胞凋亡的研究
引言
应激反应是机体在受到内外各种不利因素的刺激时，出现的一种非特异性的全身反应，由于长时间、高强度的应激刺激，造成对机体严重病理损害，包括对重要组织器官（特别是心脏）的损伤、自身免疫力的减弱以及内环境稳态的破坏等[1,2,3]。热应激可以导致鸡生长速度的降低、鸡蛋孵化率降低、可引起母鸡性激素分泌失调而导致性成熟时间推移、产蛋量显著下降，甚至热应激可以造成鸡的突然死亡[4,5]。
然而，当暴露于应激环境时（如热应激），机体的组织细胞内会快速合成一系列特异性的、具有自我保护性的蛋白，即热休克蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs），其中HSP90家族是与心脏应激性保护作用较为密切的一个HSPs家族。Hsp90作为一种重要的分子伴侣，可用通过折叠、稳定的功能来调节许多细胞内蛋白的作用，使其在应激时保持有效的生物活性[6]；所以，Hsp90在细胞抵抗应激性损伤和凋亡过程中发挥着不可缺少的作用。Hsp90的应激性表达主要受热休克因子（Heat shock factors，HSFs）的调节，所有的HSF都具有相似的结构特点，具有保守性很强的DNA结合位点。应激刺激时，激活的HSF可进入细胞核内与热休克元件（Heat shock elements，HSE）结合而激发HSPs的表达[7]。
热应激还可以引起心肌细胞caspase3的活性升高，进而导致细胞的应激性凋亡[8]。细胞凋亡（Apoptosis）是机体组织应激性损伤的主要表现形式。热应激诱导的心肌细胞凋亡会引起心脏组织中成熟心肌细胞的大量丧失，进而导致心脏组织的缺血再灌注性损伤，最终引起动物的死亡[9]。而Hsps可以调节细胞应激性生存、凋亡和死亡[10]。
作为一种非甾类药物，阿司匹林可以通过降低机体对温度的敏感性阈值而发挥解热、镇痛作用[11]。近年来，阿司匹林在治疗心血管疾病中的临床应用越来越多，其对心肌细胞的作用引起了学者的广泛关注。本文在成功建立体外鸡心肌细胞热应激模型基础上，拟动态研究阿司匹林在热应激过程中对鸡心肌细胞内Hsp90表达水平的影响及其抵抗细胞热应激凋亡的作用，并从HSFs表达动力曲线等角度探讨阿司匹林在上述过程中的调控与保护机制，为阿司匹林在畜禽养殖中抗热应激损伤应用和探索Hsp90在鸡心肌细胞发挥应激保护作用的分子机制提供理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验器材 人工气候培养箱（隔离器，RXZ500D）为中国浙江宁波新江南机械有限公司产品；Real Time PCR（Stratagene Mx3000P）为美国安莱公司产品；精细匀浆机 (623003）为上海弗鲁克公司产品；iQ5 RT荧光定量PCR仪、蛋白质电泳仪（Power PacTM Basic）和冷光/生物发光影像分析仪（LAS4000）为美国BioRad公司产品；酶标仪（Infinite M200 pro）瑞士TECAN公司产品；高速离心机（Sorval Legend Micro 17R）为美国Thermo公司产品；低速离心机（LD42A）为北京京立离心机有限公司产品；电热恒温鼓风干燥箱（DHG9245A）和隔水式恒温培养箱（GHP9160）均为上海一恒科技公司产品；手压式薄膜封口机（SF200）为中国永康市喜尚工贸有限公司产品；制冰机（KB15A）为南京先欧科技有限公司产品；涡旋仪（QL901）为海门市其林贝尔仪器制造有限公司产品；光学显微镜（AXio Cam HRC Imager A2）为德国ZEISS公司产品。电子秤（FA1004）为上海舜宇恒平科学仪器有限公司产品。
1.1.2 主要试剂 阿司匹林（A2093100MG）购自美国Sigma公司；4%多聚甲醛溶液（AR0211）购自南京鼎国生物技术有限责任公司；RNA提取试剂盒TrizolRNAiso Plus reagent (D9108A）、2×混合荧光酶试剂SYBR Premix Ex Taq (DRR041S）购自大连宝生物公司；增强型HRPDAB底物显色试剂盒（PA110）购自北京天根生化科技有限公司；cDNA 反转录试剂盒 Transcript MMLV kit (28025013）购自美国Gibco公司；Hsp90 ELISA检测试剂盒（P17142998）为美国CUSABIO? 公司产品；Hsp90大鼠单克隆抗体（ADISPA840）购自美国Enzo Life Science公司；Akt单克隆抗体（9272S）购自美国CST公司；羊抗大鼠鼠辣根过氧化物酶二抗（HD00051）、BCA蛋白定量测定试剂盒（57200150）购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluorid，PMSF，E081）购自南京建成生物工程研究所；RIPA裂解液（50 mM Tris，pH 7.4，150 mM NaCl，1% NP40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS and l mL PMSF）购自美国Thermo公司。pAkt（DRE60152）、caspase3（DRE60223）、caspase8 （DRE60228）、caspase9（DRE60231）检测试剂盒均购自南京奥青生物技术有限公司；TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（KGA7021）购自南京凯基生物科技发展有限公司。
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