某地区犬细小病毒的分离鉴定及vp2基因的遗传进化分析
1犬细小病毒病是一种具有强传染性和致死性的病毒性疾病。该病是由犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV）引起的以犬呕吐、剧烈水样腹泻且粪便腥臭带血、严重脱水、心肌炎以及体内白细胞总数下降为主要症状的传染病，主要发生在家养和野生犬科动物中。[目的] 本实验通过对大学附近地区CPV的VP2全长基因进行扩增并测序，进而对附近地区当前流行的CPV毒株进行基因变异分析。[方法] 在大学动物医院教学实习期间，采集疑似CPV感染病犬的肛拭子30份。应用PCR方法检测CPV阳性率，对于CPV阳性的样本应用猫肾传代细胞（Feline kidney 81 cell, F81）分离病毒，经过PCR扩增及序列测定的方法证明分离的病毒是否为CPV。[结果] 在30份肛拭子样本中有5份样本的PCR检测结果是CPV阳性，经过F81细胞系分毒，从5份样本中分离出5株病毒，经PCR扩增及测序分析证明所分离的病毒基因型为CPV-2a及CPV-2c。[结论] 我校教学实习医院接诊的病例证明，附近地区CPV基因型未发生突变，在可控范围内。
目录
引言
细小病毒是最小的一类单股负链DNA病毒，在自然界中分布广泛[1]。此类病毒由于体积较小且大多数成员致病性并不明显，因此起初并未引起研究人员的广泛关注。后经研究发现，犬细小病毒病是危害犬类的最主要烈性传染病之一，从而引起了公众的关注。
犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV）为细小病毒科、细小病毒亚科、细小病毒属的成员，具有本属病毒的典型形态和结构。外形呈轴对称的二十面体，电镜下观察其病毒颗粒为圆形或六边形，直径25nm左右[2]。CPV在上个世纪七十年代末发现于北美洲和欧洲，为区别于犬极小病毒（Minute virus of canine, MCV）而命名为CPV2（Canine parvovirus type 2）[3, 4]。
CPV是导致犬患心肌炎和急性出血性肠炎的主要病原体，感染CPV后，发病率为100%，死亡率占10%[5]。
早在1978年和1979年，Thomson和Kelly分别从患有肠炎的病犬粪便中分离到了CPV，为与1967年Binn等人发现的MVC区分，此病毒被命名为“2型犬细小病毒”（CPV2）[57]。在早期研究中发现 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
，CPV2可在各个品种、性别、年龄的犬种中进行快速传播，6到24周龄的幼犬发病更甚。
1983年徐汉坤等人[8]接诊一例犬群爆发传染性肠炎的病例，经过临床分析和流行病学调查，证实了犬群感染的是2型犬细小病毒，由此我国首次报道了犬细小病毒病在国内的流行传播。
1980年，Parrish等人发现新型变异株，命名为CPV2a（Canine parvovirus type 2a），此后，CPV2a逐渐取代CPV2，在世界范围内流行[9, 10]，紧接着1984年新的变异株CPV2b（Canine parvovirus type 2b）被发现，研究发现，CPV2a和CPV2b对犬细胞的适应性更强，从而扩大了宿主范围，至此2型犬细小病毒不仅可以感染犬，并且在一定情况下还可以感染猫。2000年，CPV2c（Canine parvovirus type 2c）首次由意大利分离，之后在欧洲国家、越南、北美和南美洲逐渐流行。虽然现今CPV2c已成为美洲国家和欧洲部分国家的主要流行株，但CPV2c在中国流行较晚，2010年我国才首次检测出CPV2c型变异株，2014年成功分离到了第一株中国CPV2c毒株[11]。
VP2全长1755nt，编码584个氨基酸，VP2基因编码的是CPV2的免疫原性蛋白，是CPV2的主要抗原决定簇，可刺激机体产生中和抗体。VP2基因上的蛋白转角区loop1和loop3及其N端基因属于B细胞重要的抗原表位区，此类区域的氨基酸残基的改变会导致CPV2毒株发生抗原漂移[12]。VP2基因上的几个关键碱基和氨基酸的变异都会使CPV2的抗原特异性和宿主范围发生改变[13]。
为了解当前我国南京地区CPV的流行情况，本实验进行了目前大学宠物医院接诊的来自全城各处病犬CPV基因型的调查，2017年9月10日至2017年12月31日在我校动物医院实习期间，收集得到30份疑似犬细小病毒病患犬的肛拭子，从中分离到5株病毒，经过病毒鉴定及基因变异分析，证明我们所分离的病毒均为CPV。本研究为之后实验室进行CPV变异研究、基因型调查以及防治方法提供了新的数据信息和病料基础。
实验一 犬细小病毒分离鉴定
1 材料
1．1 病料与细胞
病料样本来源于2017.9.10~2017.12.31在我校动物医院实习期间采集的疑似感染CPV的肠炎患犬肛拭子，采集的同时需登记每只患犬的年龄、品种、性别、免疫情况、体温及特征发病症状。采集好的肛拭子仅拭子部分，其余部分折断弃掉，保存于装有1~1.5ml DMEM培养液的2ml EP管中。每只患犬的肛拭子与其登记好的信息保存在一起，标记序号，防止错乱，所有病料暂存于20℃冰箱，每隔一星期用冰盒将采集好的病料从医院运送到实验室，保存于80℃冰箱中或用于病毒分离。猫肾传代细胞系（Feline kidney 81 cell, F81）为大学动物医学院免疫研究所保存。对本实验收集的样品的编号及背景信息见表1。
表1 实验样品的背景信息
Tab.1 Background of the laboratory sample collected
编号
年龄
品种
性别（雄/雌性）
免疫情况（是/否）
体温（℃）
试纸条检测（阴/阳性）
症状
01
8月龄
拉布拉多犬
雄性
是
39.8
阳性
腹泻
02
2岁
杂种犬
雌性
是
38.6
阳性
血便
03
4月龄
博美犬
雌性
否
目录
引言
细小病毒是最小的一类单股负链DNA病毒，在自然界中分布广泛[1]。此类病毒由于体积较小且大多数成员致病性并不明显，因此起初并未引起研究人员的广泛关注。后经研究发现，犬细小病毒病是危害犬类的最主要烈性传染病之一，从而引起了公众的关注。
犬细小病毒（Canine parvovirus, CPV）为细小病毒科、细小病毒亚科、细小病毒属的成员，具有本属病毒的典型形态和结构。外形呈轴对称的二十面体，电镜下观察其病毒颗粒为圆形或六边形，直径25nm左右[2]。CPV在上个世纪七十年代末发现于北美洲和欧洲，为区别于犬极小病毒（Minute virus of canine, MCV）而命名为CPV2（Canine parvovirus type 2）[3, 4]。
CPV是导致犬患心肌炎和急性出血性肠炎的主要病原体，感染CPV后，发病率为100%，死亡率占10%[5]。
早在1978年和1979年，Thomson和Kelly分别从患有肠炎的病犬粪便中分离到了CPV，为与1967年Binn等人发现的MVC区分，此病毒被命名为“2型犬细小病毒”（CPV2）[57]。在早期研究中发现 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
，CPV2可在各个品种、性别、年龄的犬种中进行快速传播，6到24周龄的幼犬发病更甚。
1983年徐汉坤等人[8]接诊一例犬群爆发传染性肠炎的病例，经过临床分析和流行病学调查，证实了犬群感染的是2型犬细小病毒，由此我国首次报道了犬细小病毒病在国内的流行传播。
1980年，Parrish等人发现新型变异株，命名为CPV2a（Canine parvovirus type 2a），此后，CPV2a逐渐取代CPV2，在世界范围内流行[9, 10]，紧接着1984年新的变异株CPV2b（Canine parvovirus type 2b）被发现，研究发现，CPV2a和CPV2b对犬细胞的适应性更强，从而扩大了宿主范围，至此2型犬细小病毒不仅可以感染犬，并且在一定情况下还可以感染猫。2000年，CPV2c（Canine parvovirus type 2c）首次由意大利分离，之后在欧洲国家、越南、北美和南美洲逐渐流行。虽然现今CPV2c已成为美洲国家和欧洲部分国家的主要流行株，但CPV2c在中国流行较晚，2010年我国才首次检测出CPV2c型变异株，2014年成功分离到了第一株中国CPV2c毒株[11]。
VP2全长1755nt，编码584个氨基酸，VP2基因编码的是CPV2的免疫原性蛋白，是CPV2的主要抗原决定簇，可刺激机体产生中和抗体。VP2基因上的蛋白转角区loop1和loop3及其N端基因属于B细胞重要的抗原表位区，此类区域的氨基酸残基的改变会导致CPV2毒株发生抗原漂移[12]。VP2基因上的几个关键碱基和氨基酸的变异都会使CPV2的抗原特异性和宿主范围发生改变[13]。
为了解当前我国南京地区CPV的流行情况，本实验进行了目前大学宠物医院接诊的来自全城各处病犬CPV基因型的调查，2017年9月10日至2017年12月31日在我校动物医院实习期间，收集得到30份疑似犬细小病毒病患犬的肛拭子，从中分离到5株病毒，经过病毒鉴定及基因变异分析，证明我们所分离的病毒均为CPV。本研究为之后实验室进行CPV变异研究、基因型调查以及防治方法提供了新的数据信息和病料基础。
实验一 犬细小病毒分离鉴定
1 材料
1．1 病料与细胞
病料样本来源于2017.9.10~2017.12.31在我校动物医院实习期间采集的疑似感染CPV的肠炎患犬肛拭子，采集的同时需登记每只患犬的年龄、品种、性别、免疫情况、体温及特征发病症状。采集好的肛拭子仅拭子部分，其余部分折断弃掉，保存于装有1~1.5ml DMEM培养液的2ml EP管中。每只患犬的肛拭子与其登记好的信息保存在一起，标记序号，防止错乱，所有病料暂存于20℃冰箱，每隔一星期用冰盒将采集好的病料从医院运送到实验室，保存于80℃冰箱中或用于病毒分离。猫肾传代细胞系（Feline kidney 81 cell, F81）为大学动物医学院免疫研究所保存。对本实验收集的样品的编号及背景信息见表1。
表1 实验样品的背景信息
Tab.1 Background of the laboratory sample collected
编号
年龄
品种
性别（雄/雌性）
免疫情况（是/否）
体温（℃）
试纸条检测（阴/阳性）
症状
01
8月龄
拉布拉多犬
雄性
是
39.8
阳性
腹泻
02
2岁
杂种犬
雌性
是
38.6
阳性
血便
03
4月龄
博美犬
雌性
否
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