一种生物巯化物的比色检测方法及应用
生物巯化物是一类重要的功能性生物分子，包括半胱氨酸（Cys）和谷胱甘肽（GSH）等，在维持细胞内环境的稳定性上起着重要作用。近几十年的研究表明，生物巯化物的代谢紊乱与许多严重的疾病过程有关，并会导致人类和许多其他动物的机体损伤。本课题基于一种比色检测方法，进行了一系列实验来检测生物样品中的生物巯化物，样品包括牛血清和六种其他不同细胞系的细胞裂解物。在测试体系中，测试溶液的颜色可以从蓝色逐渐变为无色。根据所显示的颜色变化，实验结果显示生物巯化物在胚胎成纤维细胞系中的百分比显著高于其他六种细胞系中的百分比，为以后生物巯化物的相关研究提供了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试剂与材料3
1.2 生物样品的制备3
1.2.1 牛血清的制备3
1.2.2 复苏冻存细胞3
1.2.3 细胞传代与培养3
1.2.4 提取蛋白质3
1.3 检测生物巯化物的浓度3
2 结果与分析3
2.1 比色法检测生物巯化物的机制3
2.2 生物巯化物检测的可行性和选择性4
2.3 比色法检测生物巯化物5
2.4 实际样品中的生物巯化物7
3 总结与讨论 8
3.1 实验结果分析与讨论 8
3.2 3T3H中生物巯化物的含量较高 8
致谢9
参考文献9
图1 比色法检测生物巯化物的机制4
图2 不同测试溶液的UVVis光谱5
图3 20种天然氨基酸反应后照片5
图4 20种不同氨基酸的UVVis光谱直方图5
图5 混合溶液在不同浓度Cys存在下的UVVis光谱6
图6 不同浓度的Cys的曲线6
图7 不同浓度的GSH的曲线7
图8 7种细胞裂解物的UVVis光谱直方图8
表1 牛血清中生物巯化物的测定7
一种生物巯化物的比色检测方法及应用 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
引言
引言
生物巯化物包括半胱氨酸（Cys）和谷胱甘肽（GSH）等，是一类重要的功能性生物分子，在许多生物过程中起着关键作用。近几十年来，许多研究表明，生物巯化物的代谢紊乱将导致人类和许多其他动物的机体损伤[13]。具体而言，当其在体内表达量较低时，低水平的生物巯化物可能导致机体生长缓慢，肝损伤，体重减轻及其他不利影响[1, 4, 5]；而当其在体内表达量较高时，高水平的生物巯化物则可能会引起帕金森病，阿尔茨海默病和心血管疾病等[69]，其在血浆中的含量也与艾滋病的发生有着密切的关联[10, 11]。同时谷胱甘肽的摩尔比例的改变也会导致一些生理功能障碍，例如心脏病、中风、以及其他神经系统疾病[12]。因此，对体内生物巯化物的定量检测具有重要意义。
目前，多种生物巯化物的检测方法已被建立[13, 14]，包括色谱法、电泳法和荧光法等。各类方法都有其自身的优势，其中，使用荧光探针的荧光分析法由于具有操作简单、检测灵敏以及适于细胞内检测的优势而备受关注。但同时，这些方法也存在一定的缺陷，如需要材料的预处理或昂贵的仪器设备等。在过去的几十年内，随着各种纳米材料的合成方法和生化分析平台的发展，多功能生化传感器得到了迅速发展。例如，高表面纳米材料的体积可提供大面积的高密度生化相互作用，以及它们的光学性质和化学特性构成了一个灵敏的，特别的和快速的检测平台[1518]。伴随着纳米技术的发展，多种具有优良性能的纳米材料不断的制备[1925]，尤为检测新方法的建立提供了便利。
Ran Xiang等人建立一种基于3,3，5,5四甲基联苯胺（TMB）触发的银（Ag）纳米颗粒形成的生物巯化物简单比色法检测方法[26]。在测试体系中，TMB（一种常见的显色材料）和银离子（Ag+）[27]混合后，溶液的颜色由无色变为蓝色；而当测试体系中存在生物巯化物时，生物巯化物通过与Ag+的结合，抑制TMB的氧化，因此测试溶液则不会显蓝色。由于该方法过程简单，结果可视，将该检测方法应用于实际生物样品中生物巯化物的检测，将大大降低检测所需成本。
国内也有报道原理相似的比色检测法。冯等人利用金纳米簇能模拟过氧化物酶活性的特性，使金纳米簇催化H2O2氧化底物3,3,5,5四甲基联苯胺（TMB），使TMB由无色变成蓝色，而生物巯化物的加入能抑制这一过程，基于此发展了一种比色检测癌细胞内生物巯化物的方法[28]。李介绍了一个基于免修饰的金纳米粒子用比色法来检测生物巯化物的方法[29]：使用柠檬酸钠还原的方法合成金纳米粒子，使其表面带有负电荷。在此状态下，库仑力引起的排斥力使得金纳米粒子在溶液中成分散状态。此时进行吸光度变化监测，进行UVVis光谱测量，可在 520 nm 处发现一个紫外吸收峰，同时溶液的颜色呈红色。若将 S腺苷甲硫氨酸（SAM）和该金纳米粒子溶液混合，由于 SAM 分子带正电，能够通过静电作用吸附在金纳米粒子表面，从而中和了金纳米粒子的负电荷，将导致金纳米粒子的团聚。发生该反应后，溶液的颜色由红变蓝。此时在 650 nm 会出现团聚的金纳米粒子的紫外吸收峰。若把加入生物巯化物到 SAM 和金纳米粒子的混合溶液中，由于生物巯化物含有巯基，生物巯化物能够通过 AuS 键和金纳米粒子结合，从而阻碍了 SAM 诱导金纳米粒子团聚，溶液呈红色。根据此原理，李提出了基于免修饰的金纳米粒子和SAM 的团聚和抗聚集的状态来设计的一个免标记比色分析生物巯化物的方法。此外，苏报道了将荧光法与金纳米簇结合检测生物巯化物的方法，进行了巯化物诱导的荧光增强谷脱甘肽稳定Au纳米簇的合成，进行了荧光金纳米簇的制备、荧光金纳米簇与巯化物的特异性反应，将其应用于荧光金纳米簇在肿瘤细胞的成像中[30]。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试剂与材料3
1.2 生物样品的制备3
1.2.1 牛血清的制备3
1.2.2 复苏冻存细胞3
1.2.3 细胞传代与培养3
1.2.4 提取蛋白质3
1.3 检测生物巯化物的浓度3
2 结果与分析3
2.1 比色法检测生物巯化物的机制3
2.2 生物巯化物检测的可行性和选择性4
2.3 比色法检测生物巯化物5
2.4 实际样品中的生物巯化物7
3 总结与讨论 8
3.1 实验结果分析与讨论 8
3.2 3T3H中生物巯化物的含量较高 8
致谢9
参考文献9
图1 比色法检测生物巯化物的机制4
图2 不同测试溶液的UVVis光谱5
图3 20种天然氨基酸反应后照片5
图4 20种不同氨基酸的UVVis光谱直方图5
图5 混合溶液在不同浓度Cys存在下的UVVis光谱6
图6 不同浓度的Cys的曲线6
图7 不同浓度的GSH的曲线7
图8 7种细胞裂解物的UVVis光谱直方图8
表1 牛血清中生物巯化物的测定7
一种生物巯化物的比色检测方法及应用 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
引言
引言
生物巯化物包括半胱氨酸（Cys）和谷胱甘肽（GSH）等，是一类重要的功能性生物分子，在许多生物过程中起着关键作用。近几十年来，许多研究表明，生物巯化物的代谢紊乱将导致人类和许多其他动物的机体损伤[13]。具体而言，当其在体内表达量较低时，低水平的生物巯化物可能导致机体生长缓慢，肝损伤，体重减轻及其他不利影响[1, 4, 5]；而当其在体内表达量较高时，高水平的生物巯化物则可能会引起帕金森病，阿尔茨海默病和心血管疾病等[69]，其在血浆中的含量也与艾滋病的发生有着密切的关联[10, 11]。同时谷胱甘肽的摩尔比例的改变也会导致一些生理功能障碍，例如心脏病、中风、以及其他神经系统疾病[12]。因此，对体内生物巯化物的定量检测具有重要意义。
目前，多种生物巯化物的检测方法已被建立[13, 14]，包括色谱法、电泳法和荧光法等。各类方法都有其自身的优势，其中，使用荧光探针的荧光分析法由于具有操作简单、检测灵敏以及适于细胞内检测的优势而备受关注。但同时，这些方法也存在一定的缺陷，如需要材料的预处理或昂贵的仪器设备等。在过去的几十年内，随着各种纳米材料的合成方法和生化分析平台的发展，多功能生化传感器得到了迅速发展。例如，高表面纳米材料的体积可提供大面积的高密度生化相互作用，以及它们的光学性质和化学特性构成了一个灵敏的，特别的和快速的检测平台[1518]。伴随着纳米技术的发展，多种具有优良性能的纳米材料不断的制备[1925]，尤为检测新方法的建立提供了便利。
Ran Xiang等人建立一种基于3,3，5,5四甲基联苯胺（TMB）触发的银（Ag）纳米颗粒形成的生物巯化物简单比色法检测方法[26]。在测试体系中，TMB（一种常见的显色材料）和银离子（Ag+）[27]混合后，溶液的颜色由无色变为蓝色；而当测试体系中存在生物巯化物时，生物巯化物通过与Ag+的结合，抑制TMB的氧化，因此测试溶液则不会显蓝色。由于该方法过程简单，结果可视，将该检测方法应用于实际生物样品中生物巯化物的检测，将大大降低检测所需成本。
国内也有报道原理相似的比色检测法。冯等人利用金纳米簇能模拟过氧化物酶活性的特性，使金纳米簇催化H2O2氧化底物3,3,5,5四甲基联苯胺（TMB），使TMB由无色变成蓝色，而生物巯化物的加入能抑制这一过程，基于此发展了一种比色检测癌细胞内生物巯化物的方法[28]。李介绍了一个基于免修饰的金纳米粒子用比色法来检测生物巯化物的方法[29]：使用柠檬酸钠还原的方法合成金纳米粒子，使其表面带有负电荷。在此状态下，库仑力引起的排斥力使得金纳米粒子在溶液中成分散状态。此时进行吸光度变化监测，进行UVVis光谱测量，可在 520 nm 处发现一个紫外吸收峰，同时溶液的颜色呈红色。若将 S腺苷甲硫氨酸（SAM）和该金纳米粒子溶液混合，由于 SAM 分子带正电，能够通过静电作用吸附在金纳米粒子表面，从而中和了金纳米粒子的负电荷，将导致金纳米粒子的团聚。发生该反应后，溶液的颜色由红变蓝。此时在 650 nm 会出现团聚的金纳米粒子的紫外吸收峰。若把加入生物巯化物到 SAM 和金纳米粒子的混合溶液中，由于生物巯化物含有巯基，生物巯化物能够通过 AuS 键和金纳米粒子结合，从而阻碍了 SAM 诱导金纳米粒子团聚，溶液呈红色。根据此原理，李提出了基于免修饰的金纳米粒子和SAM 的团聚和抗聚集的状态来设计的一个免标记比色分析生物巯化物的方法。此外，苏报道了将荧光法与金纳米簇结合检测生物巯化物的方法，进行了巯化物诱导的荧光增强谷脱甘肽稳定Au纳米簇的合成，进行了荧光金纳米簇的制备、荧光金纳米簇与巯化物的特异性反应，将其应用于荧光金纳米簇在肿瘤细胞的成像中[30]。
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