慢性皮质酮处理对不同TI表型肉鸡肝脏脂代谢的影响
慢性皮质酮处理对不同TI表型肉鸡肝脏脂代谢的影响[20200507190434]
摘要：紧张性静止行为（Tonic Immobility，TI）是评价动物对外界刺激恐惧程度的一个指标。本试验通过TI诱导将肉鸡分为短TI持续时间（STI）组和长TI持续时间（LTI）组，并通过皮质酮(Corticosteron， CORT)饮水处理模拟慢性应激，探讨慢性皮质酮应激对不同TI表型肉鸡肝脏脂代谢影响的可能机制。结果显示：慢性皮质酮处理显著增加肝脏中TCH和TG含量，CYP7A1、ABCA1 mRNA水平有下调的趋势，HMGCR的蛋白水平有下调趋势。表明慢性皮质酮处理导致肝脏TCH和TG含量增加可能与其转化能力下降有关。结果同样显示LTI表型肉鸡肝脏中TCH含量显著上升，ABCA1的mRNA水平和HMGCR的蛋白水平均显著高于STI组，CYP7A1的mRNA水平低于STI组。提示LTI表型肉鸡TCH含量增加可能与其合成增加，转化降低有关。
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关键字:紧张性静止行为；皮质酮；肝脏；脂代谢；肉鸡
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法1
1.1 材料 1
1.1.1 组织样品1
1.1.2 主要试剂2
1.1.3 主要仪器2
1.2 方法 2
1.2.1 肝脏中TCH、TG含量测定2
1.2.2 实时荧光相对定量PCR(Relative quantitative Real-time，RT-PCR)2
1.2.3 蛋白免疫印迹（Western blotting，WB）3
2 结果与分析5
2.1 肝脏中肝脏中TCH、TG含量5
2.2 脂代谢相关基因mRNA水平表达 5
2.3 脂代谢相关基因蛋白水平表达6
3 讨论7
致谢7
参考文献8
慢性皮质酮处理对不同TI表型肉鸡肝脏脂代谢的影响
引言
肉鸡具有生长速度快、产肉率高的特点，是全世界发展速度最快、饲养数量最多的农场动物，也是大规模、集约化、“工厂化”生产方式程度最高的农场动物，由于肉鸡在生产中存在肉鸡生长速度过快、养殖密度过大、光照不足和环境贫瘠等问题，肉鸡容易出现应激、腹水、行为限制、胸部水泡、皮肤感染等福利问题。从而影响肉鸡的生长发育、生产性能和肉品质量。因此，如何在现有的养殖模式下改善肉鸡福利状况对肉鸡业具有重要的意义。
紧张性不动是动物与生俱来的一种反应，在遇到外界强烈刺激时出现全身僵直状态并会持续一段时间。目前TI已经在多种动物上诱导成功，如甲虫[1]、鱼[2]、蜥蜴[3]、兔[4]、鼠[5]等。禽类是最常见的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
TI模式动物，TI持续时间是评定禽类恐惧程度最主要的一个指标，表现出长TI持续时间的禽类被认为其恐惧感更高及对外界刺激更敏感[6]。家禽可根据TI持续时间天然的分为LTI和STI表型。同时采用皮质酮饮水处理来模拟慢性应激。本试验拟在研究皮质酮对不同TI表型肉鸡肝脏脂代谢的影响的可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 组织样品
罗斯308肉鸡进行三次TI诱导测定，测定过程参照Jones[7]的方法。第10 d和第21 d进行TI测试，选择结果一致肉鸡进入试验处理阶段。经两次TI测定，共选出160只鸡进入预试验阶段，分为短TI持续时间组80只（29.6 ± 2.3 s）和长TI持续时间组80只（246.2 ± 26.8 s）。
22 d时将TI诱导后的肉鸡随机分为4组：低TI表型对照组、高TI表型对照组、低TI表型皮质酮处理组、高TI表型皮质酮处理组，每组共40只鸡。27 d进行皮质酮处理，将皮质酮用乙醇溶解至5 mg/mL，然后再进行1000倍稀释至饮水中，对照组饮水中添加等量乙醇。试验期15 d，试验期间自由饮水。
42 d时所有肉鸡禁食8 h后进行称重然后断头处死。采集肝脏样品，迅速放入液氮中，并转移至-70℃超低温冰箱保存。
1.1.2 主要试剂
总胆固醇试剂盒-CHO（北化康泰）；甘油三酯试剂盒-TG（北化康泰）；TRIzol试剂盒（英俊生物工程有限公司，上海）；反转录酶（M-MLV，Promega，USA）；RNA酶抑制剂（Promega，USA）；随机引物（6bp，TaKaRa Biotechnology，China）；DNA聚合酶（Taq E，TaKaRa Biotechnology，China）；SYBR Green Real-time PCR Master Mix（TaKaRa，Japan）；蛋白酶抑制剂混合片（Roche，4693132001，购于上海罗氏）；BCA蛋白测定试剂盒（Thermo，23225，购于生兴），NC膜（PALL，T91375，购于巴傲得）；发光检测试剂盒（Thermo，NC15080或34076，购于生兴）；CYP7A1抗体（abcam，ab79847）；HMGCR抗体(bioworld，BS6625)。
1.1.3 主要仪器
Nandodrop ND-1000（Thermo Scientific）；PCR仪（PTC200.Bio-Rad，USA）；全自动凝胶成像分析系统（VersaDoc 4000MP）；低温组织破碎仪（Micro Smash MS100R）；Mx3000P real-time PCR（Stratagene，BioTek，USA）。
1.2 方法
1.2.1 肝脏中TCH、TG含量测定
称取约50 mg肝脏样品，称重记录，按照1:5的比例加入RIPA。匀浆后取200 μL匀浆液，加入800 μL的氯仿甲醇混合液（氯仿：甲醇=2:1）。剧烈振荡1 min，室温静置30 min后重复振荡静置。2000 rpm，10 min离心，取下层有机物400 μL进行测定。设置空白对照和标准品对照，37℃反应5 min后用酶标仪在500 nm下测吸光值。
TG(mmol/L *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
)=As/Ao*Cs(Cs=2.258mmol/L)
TCH(mmol/L)=As/Ao*Cs(Cs=5.17mmol/L)
注：As 样品吸光值-空白对照吸光值
Ao 标准品的吸光值
数据通过SPSS 20分析，通过软件GraphPad prism 5作图。
1.2.2 实时荧光相对定量PCR(Relative quantitative Real-time，RT-PCR)
1.2.2.1 RNA提取及反转录
低温剪取约50mg组织，加入1 mL TRIzol，用低温组织破碎仪进行匀浆处理。将匀浆样品在室温（15～30oC）放置5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡60 s，室温放置3 min。4oC 10000 rpm离心15 min。样品分为三层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。记录抽取水相的量，把水相转移到新的1.5 mL Eppendorf管中，用等体积的预冷的异丙醇过夜沉淀水相中的RNA。4oC 10000 rpm离心10 min，离心后在管侧和管底出现白色半透明状沉淀，弃上清。用75%乙醇洗涤沉淀2次，晾至半干，加适量DEPC水溶解。
用紫外分光光度计测总RNA的浓度（260 nm），RNA样品260/280 nm吸光率比值均在1.9~2.1范围内。从每个RNA样品中取4.4 μL（1 μg/μL），通过1.4%的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，EB染色后，用Kodak1D电泳凝胶成像系统分析RNA条带。条带清晰，无拖尾现象，且28S与18S条带灰度之比约为2:1，表明RNA无降解，质量可靠。根据浓度稀释至统一浓度。取1 ug用随机引物对所有样品进行RT。得到cDNA原液。取2 μL稀释40倍进行Real-time RT-PCR。
图 4 肝脏中CYP7A1 蛋白含量
3 讨论
摘要：紧张性静止行为（Tonic Immobility，TI）是评价动物对外界刺激恐惧程度的一个指标。本试验通过TI诱导将肉鸡分为短TI持续时间（STI）组和长TI持续时间（LTI）组，并通过皮质酮(Corticosteron， CORT)饮水处理模拟慢性应激，探讨慢性皮质酮应激对不同TI表型肉鸡肝脏脂代谢影响的可能机制。结果显示：慢性皮质酮处理显著增加肝脏中TCH和TG含量，CYP7A1、ABCA1 mRNA水平有下调的趋势，HMGCR的蛋白水平有下调趋势。表明慢性皮质酮处理导致肝脏TCH和TG含量增加可能与其转化能力下降有关。结果同样显示LTI表型肉鸡肝脏中TCH含量显著上升，ABCA1的mRNA水平和HMGCR的蛋白水平均显著高于STI组，CYP7A1的mRNA水平低于STI组。提示LTI表型肉鸡TCH含量增加可能与其合成增加，转化降低有关。
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关键字:紧张性静止行为；皮质酮；肝脏；脂代谢；肉鸡
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法1
1.1 材料 1
1.1.1 组织样品1
1.1.2 主要试剂2
1.1.3 主要仪器2
1.2 方法 2
1.2.1 肝脏中TCH、TG含量测定2
1.2.2 实时荧光相对定量PCR(Relative quantitative Real-time，RT-PCR)2
1.2.3 蛋白免疫印迹（Western blotting，WB）3
2 结果与分析5
2.1 肝脏中肝脏中TCH、TG含量5
2.2 脂代谢相关基因mRNA水平表达 5
2.3 脂代谢相关基因蛋白水平表达6
3 讨论7
致谢7
参考文献8
慢性皮质酮处理对不同TI表型肉鸡肝脏脂代谢的影响
引言
肉鸡具有生长速度快、产肉率高的特点，是全世界发展速度最快、饲养数量最多的农场动物，也是大规模、集约化、“工厂化”生产方式程度最高的农场动物，由于肉鸡在生产中存在肉鸡生长速度过快、养殖密度过大、光照不足和环境贫瘠等问题，肉鸡容易出现应激、腹水、行为限制、胸部水泡、皮肤感染等福利问题。从而影响肉鸡的生长发育、生产性能和肉品质量。因此，如何在现有的养殖模式下改善肉鸡福利状况对肉鸡业具有重要的意义。
紧张性不动是动物与生俱来的一种反应，在遇到外界强烈刺激时出现全身僵直状态并会持续一段时间。目前TI已经在多种动物上诱导成功，如甲虫[1]、鱼[2]、蜥蜴[3]、兔[4]、鼠[5]等。禽类是最常见的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
TI模式动物，TI持续时间是评定禽类恐惧程度最主要的一个指标，表现出长TI持续时间的禽类被认为其恐惧感更高及对外界刺激更敏感[6]。家禽可根据TI持续时间天然的分为LTI和STI表型。同时采用皮质酮饮水处理来模拟慢性应激。本试验拟在研究皮质酮对不同TI表型肉鸡肝脏脂代谢的影响的可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 组织样品
罗斯308肉鸡进行三次TI诱导测定，测定过程参照Jones[7]的方法。第10 d和第21 d进行TI测试，选择结果一致肉鸡进入试验处理阶段。经两次TI测定，共选出160只鸡进入预试验阶段，分为短TI持续时间组80只（29.6 ± 2.3 s）和长TI持续时间组80只（246.2 ± 26.8 s）。
22 d时将TI诱导后的肉鸡随机分为4组：低TI表型对照组、高TI表型对照组、低TI表型皮质酮处理组、高TI表型皮质酮处理组，每组共40只鸡。27 d进行皮质酮处理，将皮质酮用乙醇溶解至5 mg/mL，然后再进行1000倍稀释至饮水中，对照组饮水中添加等量乙醇。试验期15 d，试验期间自由饮水。
42 d时所有肉鸡禁食8 h后进行称重然后断头处死。采集肝脏样品，迅速放入液氮中，并转移至-70℃超低温冰箱保存。
1.1.2 主要试剂
总胆固醇试剂盒-CHO（北化康泰）；甘油三酯试剂盒-TG（北化康泰）；TRIzol试剂盒（英俊生物工程有限公司，上海）；反转录酶（M-MLV，Promega，USA）；RNA酶抑制剂（Promega，USA）；随机引物（6bp，TaKaRa Biotechnology，China）；DNA聚合酶（Taq E，TaKaRa Biotechnology，China）；SYBR Green Real-time PCR Master Mix（TaKaRa，Japan）；蛋白酶抑制剂混合片（Roche，4693132001，购于上海罗氏）；BCA蛋白测定试剂盒（Thermo，23225，购于生兴），NC膜（PALL，T91375，购于巴傲得）；发光检测试剂盒（Thermo，NC15080或34076，购于生兴）；CYP7A1抗体（abcam，ab79847）；HMGCR抗体(bioworld，BS6625)。
1.1.3 主要仪器
Nandodrop ND-1000（Thermo Scientific）；PCR仪（PTC200.Bio-Rad，USA）；全自动凝胶成像分析系统（VersaDoc 4000MP）；低温组织破碎仪（Micro Smash MS100R）；Mx3000P real-time PCR（Stratagene，BioTek，USA）。
1.2 方法
1.2.1 肝脏中TCH、TG含量测定
称取约50 mg肝脏样品，称重记录，按照1:5的比例加入RIPA。匀浆后取200 μL匀浆液，加入800 μL的氯仿甲醇混合液（氯仿：甲醇=2:1）。剧烈振荡1 min，室温静置30 min后重复振荡静置。2000 rpm，10 min离心，取下层有机物400 μL进行测定。设置空白对照和标准品对照，37℃反应5 min后用酶标仪在500 nm下测吸光值。
TG(mmol/L *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
)=As/Ao*Cs(Cs=2.258mmol/L)
TCH(mmol/L)=As/Ao*Cs(Cs=5.17mmol/L)
注：As 样品吸光值-空白对照吸光值
Ao 标准品的吸光值
数据通过SPSS 20分析，通过软件GraphPad prism 5作图。
1.2.2 实时荧光相对定量PCR(Relative quantitative Real-time，RT-PCR)
1.2.2.1 RNA提取及反转录
低温剪取约50mg组织，加入1 mL TRIzol，用低温组织破碎仪进行匀浆处理。将匀浆样品在室温（15～30oC）放置5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡60 s，室温放置3 min。4oC 10000 rpm离心15 min。样品分为三层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。记录抽取水相的量，把水相转移到新的1.5 mL Eppendorf管中，用等体积的预冷的异丙醇过夜沉淀水相中的RNA。4oC 10000 rpm离心10 min，离心后在管侧和管底出现白色半透明状沉淀，弃上清。用75%乙醇洗涤沉淀2次，晾至半干，加适量DEPC水溶解。
用紫外分光光度计测总RNA的浓度（260 nm），RNA样品260/280 nm吸光率比值均在1.9~2.1范围内。从每个RNA样品中取4.4 μL（1 μg/μL），通过1.4%的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，EB染色后，用Kodak1D电泳凝胶成像系统分析RNA条带。条带清晰，无拖尾现象，且28S与18S条带灰度之比约为2:1，表明RNA无降解，质量可靠。根据浓度稀释至统一浓度。取1 ug用随机引物对所有样品进行RT。得到cDNA原液。取2 μL稀释40倍进行Real-time RT-PCR。
图 4 肝脏中CYP7A1 蛋白含量
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