猪ctss基因snp检测及其与肉质性状关联分析
摘 要猪肉肌内脂肪（intramuscular fat，IMF）的含量与肉的品种密切相关，因此，提高肌内脂肪含量是改善猪肉品质的有效途径之一。CTSS基因属于cathepsin家族，即溶酶体组织蛋白酶家族。目前，大量研究指出CTSS基因与脂肪分化发育有关。实验室前期通过SNP芯片在全基因组水平上筛查到一个定位于CTSS基因内含子、与肌内脂肪含量潜在相关的候选SNP (MARC0047358)，本研究采用PCR-SSCP技术对个体进行基因分型，在大样本群体中验证候选SNP位点与肌内脂肪含量的关系，结果发现AA基因型和AG基因型个体的肌内脂肪含量显著高于GG基因型个体，因此推测该突变位点与肌内脂肪含量相关。综上所述，本研究确定了CTSS基因中候选SNP位点对肌内脂肪含量影响，为优质肉品种猪的选育提供了有效分子标记。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料与方法5
1.1实验材料 5
1.1.1 实验动物5
1.1.2 主要试剂5
1.1.3 网络资源及软件5
1.1.4 仪器设备5
1.2 方法 5
1.2.1基因组DNA提取5
1.2.2 引物设计及PCR扩增6
1.2.3 PCRSSCP分析7
2 结果与分析8
2.1 CTSS片段的PCR扩增8
2.2 CTSS内含子区SNP位点基因分型结果8
2.3数据统计与分析9
3 讨论11
致谢12
参考文献12
猪CTSS基因SNP检测及其与肉质性状关联分析
引言
现阶段，随着经济水平的不断发展，人民生活水平也在不断提高，消费者对猪肉的品质提出了越来越高的要求。猪肉肌内脂肪（intramuscular fat，IMF）的含量与肉的品质密切相关，对肉的嫩度、多汁性和风味有明显的正效应[1]，特别是对肉的嫩度有显著影响[2]。肌内脂肪含量的增加从两个方面改善猪肉嫩度，一方面是切断肌纤维束间的交联结构，另外一方面是利于咀嚼过程中肌纤 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
维的断裂。总体上来讲，肌内脂肪含量的提高能够很好改善猪肉的感观品质和食用品质，因此，提高肌内脂肪含量是改善猪肉品质的有效途径[3]。
肌内脂肪含量是一个中等遗传力性状，理论上讲，常规表型选择方法对这类性状的选育提高具有较好的效果。然而，肌内脂肪含量无法在活体进行直接测定，只有屠宰后才能确定，利用标记辅助选择技术可以实现对其的活体选育，而找到肌内脂肪含量的关键基因或紧密连锁标记是进行标记辅助选择的前提[46]。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms , SNPs) 作为新的遗传标记，已广泛应用于基因定位、克隆和遗传多样性的研究。SNP是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的一种DNA序列多态性，通过在全基因组水平上筛选与肌内脂肪含量关联的SNPs，根据SNP在基因组中的位置以及连锁不平衡分析推测可能的候选基因，再对这些候选基因与肌内脂肪的关系进行验证和功能研究。目前影响肌内脂肪含量的最主效基因还没有统一定论，因此对各种有可能影响肌内脂肪的基因的研究成为热点。
CTSS基因属于cathepsin家族，即溶酶体组织蛋白酶家族。大量的研究指出，cathepsin 家族对许多生理过程均具有调节作用，而该家族成员是通过分泌活性蛋白质来降解细胞外基质的某些组分，例如纤连蛋白、骨粘连蛋白来发挥作用。Cathepsin 家族的多名成员，例如CTSB 通过降解ECM 来影响血管的生成，被称作血管生成的“开关”[78]。CTSK、CTSS等均被报道与脂肪分化发育有关[911]。因此研究Cathepsin家族对脂肪的影响对猪育种工作有重要意义。本研究采用PCRSSCP技术和性状关联分析对前期筛选的肌内脂肪含量相关SNP进行鉴定，以期验证CTSS基因对肌内脂肪含量影响，为优质肉品种猪的选育提高有效的分子标记。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 实验动物
试验动物为95头大白猪、长白猪、皮特兰猪、杜洛克猪四元杂交商品猪。采取背最长肌迅速投于液氮中带回并于液氮罐中保存以便提取DNA，另外本实验室前期已经完成背最长肌的肌内脂肪含量测定工作，成功收集了相应数据。
1.1.2 主要试剂
（1）DNA提取试剂
Tris–HCL 1mol/L PH8.0、生理盐水、EDTA、TES缓冲液（释放DNA）、10% SDS（变性剂，破细胞壁）、蛋白酶K（降解蛋白质）、RNA酶 （降解RNA）、 氯仿、TE缓冲液（溶解DNA）。
（2）PCR及电泳试剂
PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成；RNase抑制剂、rTaq、SYBR Premix Ex TaqTM、DNA Marker均购自Takara公司。
（3）其它试剂
rTaq DNA聚合酶、DNA Marker等均购自TAKARA宝生物有限公司。
1.1.3 网络资源及软件
美国国家信息中心：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
基于BLAST检索：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/
引物设计：PremierPremier 5.0
1.1.4 仪器设备
高速冷冻离心机：Eppendorf
梯度PCR仪：PTC100，MJ Research
可调式微量移液器：Eppendorf
电泳凝胶成像系统：上海天能有限公司GIS凝胶图像处理系统(Version 3.71)
Uv754型紫外分光光度计：上海医用仪器厂
电子天平：Yamatoz
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取
采用酚——氯仿抽提法从猪背最长肌组织中提取基因组DNA，用紫外分光光度计估计含量。
(1) 取约100mg背最长肌组织放于玻璃研磨器内，加1mL细胞裂解液，用玻璃匀浆器匀浆。
(2) 匀浆液倒入2mL塑料离心管中，加20μL蛋白酶K，再加SDS至终浓度为1％，上下颠倒混匀。
(3) 混合液置于55℃水浴过夜。
(4) 水浴完毕后，向匀浆液中按1：1比例加酚/氯仿/异戊醇混合液（25：24：1），轻轻震荡混匀5min，12000g离心5min。
(5) 吸上层水相800μL于一灭菌塑料离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，轻轻震荡混匀5min，12000g离心5 min。
(6) 吸上层水相500μL于一塑料离心管中，加入两倍体积的无水乙醇（乙醇事先经过20℃预冷）
(7) 12000g离心5min，沉淀DNA,倾去上清液。
(8) 于沉淀中加入75%乙醇溶液500μL，轻轻混匀后12000g离心5min，倾去上清液，室温凉干。
(9) 在管中加20uL的ddH2O水溶解，，20℃保存备用。
(10) 用紫外分光光度计进行浓度测定。
1.2.2 引物设计及PCR扩增
由SNP分型结果初筛得到该差异显著SNP（MARC0047358）位点，由NCBI查得该SNP位点定位于CTSS基因内含子上，利用引物设计软件Primer5.0设计包含该SNP位点的CTSS片段引物。上游引物：5CAACTGCACCAAGTCAAT 3，下游引物：5AGCCCACATTTCTTTCTAAC3。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料与方法5
1.1实验材料 5
1.1.1 实验动物5
1.1.2 主要试剂5
1.1.3 网络资源及软件5
1.1.4 仪器设备5
1.2 方法 5
1.2.1基因组DNA提取5
1.2.2 引物设计及PCR扩增6
1.2.3 PCRSSCP分析7
2 结果与分析8
2.1 CTSS片段的PCR扩增8
2.2 CTSS内含子区SNP位点基因分型结果8
2.3数据统计与分析9
3 讨论11
致谢12
参考文献12
猪CTSS基因SNP检测及其与肉质性状关联分析
引言
现阶段，随着经济水平的不断发展，人民生活水平也在不断提高，消费者对猪肉的品质提出了越来越高的要求。猪肉肌内脂肪（intramuscular fat，IMF）的含量与肉的品质密切相关，对肉的嫩度、多汁性和风味有明显的正效应[1]，特别是对肉的嫩度有显著影响[2]。肌内脂肪含量的增加从两个方面改善猪肉嫩度，一方面是切断肌纤维束间的交联结构，另外一方面是利于咀嚼过程中肌纤 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
维的断裂。总体上来讲，肌内脂肪含量的提高能够很好改善猪肉的感观品质和食用品质，因此，提高肌内脂肪含量是改善猪肉品质的有效途径[3]。
肌内脂肪含量是一个中等遗传力性状，理论上讲，常规表型选择方法对这类性状的选育提高具有较好的效果。然而，肌内脂肪含量无法在活体进行直接测定，只有屠宰后才能确定，利用标记辅助选择技术可以实现对其的活体选育，而找到肌内脂肪含量的关键基因或紧密连锁标记是进行标记辅助选择的前提[46]。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms , SNPs) 作为新的遗传标记，已广泛应用于基因定位、克隆和遗传多样性的研究。SNP是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的一种DNA序列多态性，通过在全基因组水平上筛选与肌内脂肪含量关联的SNPs，根据SNP在基因组中的位置以及连锁不平衡分析推测可能的候选基因，再对这些候选基因与肌内脂肪的关系进行验证和功能研究。目前影响肌内脂肪含量的最主效基因还没有统一定论，因此对各种有可能影响肌内脂肪的基因的研究成为热点。
CTSS基因属于cathepsin家族，即溶酶体组织蛋白酶家族。大量的研究指出，cathepsin 家族对许多生理过程均具有调节作用，而该家族成员是通过分泌活性蛋白质来降解细胞外基质的某些组分，例如纤连蛋白、骨粘连蛋白来发挥作用。Cathepsin 家族的多名成员，例如CTSB 通过降解ECM 来影响血管的生成，被称作血管生成的“开关”[78]。CTSK、CTSS等均被报道与脂肪分化发育有关[911]。因此研究Cathepsin家族对脂肪的影响对猪育种工作有重要意义。本研究采用PCRSSCP技术和性状关联分析对前期筛选的肌内脂肪含量相关SNP进行鉴定，以期验证CTSS基因对肌内脂肪含量影响，为优质肉品种猪的选育提高有效的分子标记。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 实验动物
试验动物为95头大白猪、长白猪、皮特兰猪、杜洛克猪四元杂交商品猪。采取背最长肌迅速投于液氮中带回并于液氮罐中保存以便提取DNA，另外本实验室前期已经完成背最长肌的肌内脂肪含量测定工作，成功收集了相应数据。
1.1.2 主要试剂
（1）DNA提取试剂
Tris–HCL 1mol/L PH8.0、生理盐水、EDTA、TES缓冲液（释放DNA）、10% SDS（变性剂，破细胞壁）、蛋白酶K（降解蛋白质）、RNA酶 （降解RNA）、 氯仿、TE缓冲液（溶解DNA）。
（2）PCR及电泳试剂
PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成；RNase抑制剂、rTaq、SYBR Premix Ex TaqTM、DNA Marker均购自Takara公司。
（3）其它试剂
rTaq DNA聚合酶、DNA Marker等均购自TAKARA宝生物有限公司。
1.1.3 网络资源及软件
美国国家信息中心：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
基于BLAST检索：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/
引物设计：PremierPremier 5.0
1.1.4 仪器设备
高速冷冻离心机：Eppendorf
梯度PCR仪：PTC100，MJ Research
可调式微量移液器：Eppendorf
电泳凝胶成像系统：上海天能有限公司GIS凝胶图像处理系统(Version 3.71)
Uv754型紫外分光光度计：上海医用仪器厂
电子天平：Yamatoz
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取
采用酚——氯仿抽提法从猪背最长肌组织中提取基因组DNA，用紫外分光光度计估计含量。
(1) 取约100mg背最长肌组织放于玻璃研磨器内，加1mL细胞裂解液，用玻璃匀浆器匀浆。
(2) 匀浆液倒入2mL塑料离心管中，加20μL蛋白酶K，再加SDS至终浓度为1％，上下颠倒混匀。
(3) 混合液置于55℃水浴过夜。
(4) 水浴完毕后，向匀浆液中按1：1比例加酚/氯仿/异戊醇混合液（25：24：1），轻轻震荡混匀5min，12000g离心5min。
(5) 吸上层水相800μL于一灭菌塑料离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，轻轻震荡混匀5min，12000g离心5 min。
(6) 吸上层水相500μL于一塑料离心管中，加入两倍体积的无水乙醇（乙醇事先经过20℃预冷）
(7) 12000g离心5min，沉淀DNA,倾去上清液。
(8) 于沉淀中加入75%乙醇溶液500μL，轻轻混匀后12000g离心5min，倾去上清液，室温凉干。
(9) 在管中加20uL的ddH2O水溶解，，20℃保存备用。
(10) 用紫外分光光度计进行浓度测定。
1.2.2 引物设计及PCR扩增
由SNP分型结果初筛得到该差异显著SNP（MARC0047358）位点，由NCBI查得该SNP位点定位于CTSS基因内含子上，利用引物设计软件Primer5.0设计包含该SNP位点的CTSS片段引物。上游引物：5CAACTGCACCAAGTCAAT 3，下游引物：5AGCCCACATTTCTTTCTAAC3。
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