猪伪狂犬病毒（prv）耐热冻干疫苗工艺的初步研究
良好的疫苗冻干工艺不仅为疫苗的冷链运输和贮藏提供了便利，使疫苗能在较高温度下保存较长时间，并且保证了活疫苗的效价。本试验通过配制3种耐热保护剂，分别与猪伪狂犬病毒（PRV）弱毒原液按一定比例混合，选取本实验室最优冻干参数制定冻干曲线，经过预冻、一次干燥、二次干燥、压塞后出舱，制备出形态较为合格的试验用冻干疫苗。最后通过形态观察、内毒素含量测定、耐热性能及病毒滴度测定得出最佳的耐热保护剂配方。结果显示三种配方的形态均有小部分存在瑕疵，大部分有良好的形态；内毒素含量均小于4EU/ML,符合国家对猪伪狂犬疫苗的控制要求;耐热性能及病毒滴度测定中，一号配方的耐热冻干损失均明显低于二三号配方。表明1号配方优于2、3号配方。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试验材料 2
1.1.1 仪器2
1.1.2 耗材2
1.1.3 试剂2
1.1.4 生物材料2
1.2 试验方法2
1.2.1 耐热保护剂配方的配制2
1.2.2 配苗3
1.2.3 冷冻干燥步骤3
1.2.4 样品外观形态的观察3
1.2.5 样品内毒素含量的测定3
1.2.6 样品耐热性能及病毒滴度的测定3
2 结果与分析4
2. 1 冻干样品的形态观察4
2. 2 样品内毒素含量、耐热性能及病毒滴度测定4
3 讨论 5
3. 1 猪伪狂犬疫苗样品的外观形态5
3. 2 猪伪狂犬疫苗样品的内毒素含量6
3. 3 猪伪狂犬疫苗样品的耐热性能及病毒滴度测定6
3. 4 总结7
致谢7
参考文献7
猪伪狂犬病毒（PRV）耐热冻干疫苗工艺的初步研究
引言
猪伪狂犬是由猪伪狂犬病毒（Porcine pseudorabies virus）感染猪引起的急性传染病，该病毒属于疱疹病毒科( Herpesviridae) [1]， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
是引起多种家畜以发热、奇痒(猪除外)、繁殖障碍、脑脊髓炎为主要症状的一种高度接触性传染病[2]。
伪狂犬病毒是疱疹病毒科中抵抗力较强的一种。在37℃下的半衰期为7h，8℃可存活46天，而在25℃干草、树枝、食物上可存活10~30天，但短期保存病毒时，4℃~15℃和20℃冻结保存更好。病毒在pH4~9之间保持稳定。5%石炭酸经2min灭活，但0.5%石炭酸处理32天后仍具有感染性,0.5%~1%氢氧化钠迅速使其灭活。对乙醚、氯仿等脂溶剂以及福尔马林和紫外线照射敏感。
伪狂犬病毒只有一个血清型，但不同毒株在毒力和生物学特征等方面存在差异。伪狂犬病毒具有泛嗜性，能在多种组织培养细胞内增殖，其中以兔肾和猪肾细胞(包括原I代细胞和传代细胞系)最为敏感，并引起明显的细胞病变，细胞肿胀变圆，开始呈散在的灶状，随后逐渐扩展，直至全部细胞圆缩脱落，同时有大量多核巨细胞形成。细胞病变出现快，当病毒接种量大时，在18~24h后即能看到典型的细胞病变。
实验动物也可用于病毒的分离。在兔和日龄小鼠组织培养之间对伪狂犬病毒的敏感性无显著差异，但成年鼠与新生鼠相比有较强的抵抗力。虽然鸡胚对伪狂犬病毒不很敏感，但应用鸡胚绒毛尿囊膜接种是最早用于病毒增殖和传代的方法。
当前动物疫苗中冻干活疫苗占有相当大的比例，但其热稳定性和保护功能差，而且产品对冷链的要求高，2～8℃条件下，保存期只有3～6个月，大多需要在15℃以下保存，这给疫苗的储存和运输带来很大的困难，并且容易导致疫苗效价下降或失效，导致免疫失败[3]。活疫苗从工厂产出后首先运输到省市兽医站冷冻保存，接着输送到县乡级兽医站冷冻保存，最后才能运输到养殖场户直接使用或冷冻保存。运输过程必须满足冷藏的效果，即2～8℃；冷冻保存需满足15℃，这些冷藏与冷冻的环节链接起来形成了“冷链”。要有一个环节未达到“冷链”的要求，疫苗效价就要降低甚至失效[4]。而耐热冻干活疫苗的技术可以解决活疫苗处于冷冻链系统中，容易疫苗失活，造成免疫失败的问题。耐热冻干疫苗由于有耐热冻干保护剂的作用可在28℃的条件下保存长达1236个月。
耐热冻干保护剂由大分子物质，小分子物质和抗氧化剂等部分组成。大分子物质起到耐热性构架的作用，对构架外热源进行阻隔，防止构架内的病毒的受到外热源的热传导性和热辐射性杀伤，同时可以促进冷冻干燥中的升华。小分子物质可以让病毒在冷冻干燥过程中均匀悬浮在耐热保护剂配方中，可使病毒尽量保持存活，尽可能地保存冻干样品中的水分，从而保证蛋白活性。抗氧化剂可组止病毒在干燥状态下与氧接触加速新陈代谢，加快死亡[5]。
保护剂的保护功能不仅与材料、配比及冻干曲线有关,微生物种类不同、本身结构的差异(如病毒粒子有无囊膜)、对外界抵抗力强弱和培养方法的不同也是重要的影响因素。因而不同种类的疫苗的保护剂配方也应有所不同[6]。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 仪器 冷冻干燥机，美国VirTis adVantage Plus、DZF型真空干燥箱，上海一恒科技有限公司、FA2004电子精密天平，LIANG PING压盖机，高压锅，干烤箱，烘箱等。
1．1．2 耗材 细胞培养瓶、细胞盖、枪头高压烘干待用、美国Millipore一次性针头过滤器、山东省药用玻璃股份有限公司产5ml低硼硅胶玻璃管制注射剂瓶、江苏华兰药用新材料股份有限公司生产的注射用冷冻干燥无菌粉末用氯化丁基橡胶塞、96孔板。
1．1．3 试剂 DMEM细胞培养液、血清、双抗、蔗糖、乳糖、甘露醇、谷氨酸钠、Dextran70%、甘氨酸、谷氨酸钠、精氨酸、甲硫氨酸、双蒸水。
1．1．4 生物材料 猪伪狂犬原毒株
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试验材料 2
1.1.1 仪器2
1.1.2 耗材2
1.1.3 试剂2
1.1.4 生物材料2
1.2 试验方法2
1.2.1 耐热保护剂配方的配制2
1.2.2 配苗3
1.2.3 冷冻干燥步骤3
1.2.4 样品外观形态的观察3
1.2.5 样品内毒素含量的测定3
1.2.6 样品耐热性能及病毒滴度的测定3
2 结果与分析4
2. 1 冻干样品的形态观察4
2. 2 样品内毒素含量、耐热性能及病毒滴度测定4
3 讨论 5
3. 1 猪伪狂犬疫苗样品的外观形态5
3. 2 猪伪狂犬疫苗样品的内毒素含量6
3. 3 猪伪狂犬疫苗样品的耐热性能及病毒滴度测定6
3. 4 总结7
致谢7
参考文献7
猪伪狂犬病毒（PRV）耐热冻干疫苗工艺的初步研究
引言
猪伪狂犬是由猪伪狂犬病毒（Porcine pseudorabies virus）感染猪引起的急性传染病，该病毒属于疱疹病毒科( Herpesviridae) [1]， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
是引起多种家畜以发热、奇痒(猪除外)、繁殖障碍、脑脊髓炎为主要症状的一种高度接触性传染病[2]。
伪狂犬病毒是疱疹病毒科中抵抗力较强的一种。在37℃下的半衰期为7h，8℃可存活46天，而在25℃干草、树枝、食物上可存活10~30天，但短期保存病毒时，4℃~15℃和20℃冻结保存更好。病毒在pH4~9之间保持稳定。5%石炭酸经2min灭活，但0.5%石炭酸处理32天后仍具有感染性,0.5%~1%氢氧化钠迅速使其灭活。对乙醚、氯仿等脂溶剂以及福尔马林和紫外线照射敏感。
伪狂犬病毒只有一个血清型，但不同毒株在毒力和生物学特征等方面存在差异。伪狂犬病毒具有泛嗜性，能在多种组织培养细胞内增殖，其中以兔肾和猪肾细胞(包括原I代细胞和传代细胞系)最为敏感，并引起明显的细胞病变，细胞肿胀变圆，开始呈散在的灶状，随后逐渐扩展，直至全部细胞圆缩脱落，同时有大量多核巨细胞形成。细胞病变出现快，当病毒接种量大时，在18~24h后即能看到典型的细胞病变。
实验动物也可用于病毒的分离。在兔和日龄小鼠组织培养之间对伪狂犬病毒的敏感性无显著差异，但成年鼠与新生鼠相比有较强的抵抗力。虽然鸡胚对伪狂犬病毒不很敏感，但应用鸡胚绒毛尿囊膜接种是最早用于病毒增殖和传代的方法。
当前动物疫苗中冻干活疫苗占有相当大的比例，但其热稳定性和保护功能差，而且产品对冷链的要求高，2～8℃条件下，保存期只有3～6个月，大多需要在15℃以下保存，这给疫苗的储存和运输带来很大的困难，并且容易导致疫苗效价下降或失效，导致免疫失败[3]。活疫苗从工厂产出后首先运输到省市兽医站冷冻保存，接着输送到县乡级兽医站冷冻保存，最后才能运输到养殖场户直接使用或冷冻保存。运输过程必须满足冷藏的效果，即2～8℃；冷冻保存需满足15℃，这些冷藏与冷冻的环节链接起来形成了“冷链”。要有一个环节未达到“冷链”的要求，疫苗效价就要降低甚至失效[4]。而耐热冻干活疫苗的技术可以解决活疫苗处于冷冻链系统中，容易疫苗失活，造成免疫失败的问题。耐热冻干疫苗由于有耐热冻干保护剂的作用可在28℃的条件下保存长达1236个月。
耐热冻干保护剂由大分子物质，小分子物质和抗氧化剂等部分组成。大分子物质起到耐热性构架的作用，对构架外热源进行阻隔，防止构架内的病毒的受到外热源的热传导性和热辐射性杀伤，同时可以促进冷冻干燥中的升华。小分子物质可以让病毒在冷冻干燥过程中均匀悬浮在耐热保护剂配方中，可使病毒尽量保持存活，尽可能地保存冻干样品中的水分，从而保证蛋白活性。抗氧化剂可组止病毒在干燥状态下与氧接触加速新陈代谢，加快死亡[5]。
保护剂的保护功能不仅与材料、配比及冻干曲线有关,微生物种类不同、本身结构的差异(如病毒粒子有无囊膜)、对外界抵抗力强弱和培养方法的不同也是重要的影响因素。因而不同种类的疫苗的保护剂配方也应有所不同[6]。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 仪器 冷冻干燥机，美国VirTis adVantage Plus、DZF型真空干燥箱，上海一恒科技有限公司、FA2004电子精密天平，LIANG PING压盖机，高压锅，干烤箱，烘箱等。
1．1．2 耗材 细胞培养瓶、细胞盖、枪头高压烘干待用、美国Millipore一次性针头过滤器、山东省药用玻璃股份有限公司产5ml低硼硅胶玻璃管制注射剂瓶、江苏华兰药用新材料股份有限公司生产的注射用冷冻干燥无菌粉末用氯化丁基橡胶塞、96孔板。
1．1．3 试剂 DMEM细胞培养液、血清、双抗、蔗糖、乳糖、甘露醇、谷氨酸钠、Dextran70%、甘氨酸、谷氨酸钠、精氨酸、甲硫氨酸、双蒸水。
1．1．4 生物材料 猪伪狂犬原毒株
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