母体营养限饲对新生仔鼠小肠自噬的影响
本研究分析了母体营养限饲对新生仔鼠小肠组织的影响，检测了自噬及其相关信号通路在仔鼠小肠组织中的表达规律。结果显示与对照组相比，孕期母鼠日粮进行限饲显著降低仔鼠新生重及血糖含量（P<0.01）。母体营养限饲导致新生仔鼠组织器官重量均呈减少趋势，胰腺和肾脏的重量显著下降（P<0.05），而脾脏、肠、胃的重量极显著降低（P<0.01）。WIPI1、LC3B、LC3A、Atg5、Atg7等自噬相关基因在限饲组的小肠组织中的表达均高于其在对照组小肠组织中的表达；其中WIPI1基因在限饲组小肠组织中的表达极显著高于其在对照组相同部位的表达（P<0.01）；LC3B、Atg5、Atg7基因在限饲组小肠组织中的表达显著高于其在对照组相同部位的表达（P<0.05）；LC3A基因在限饲组小肠组织中的表达相较其在对照组相同部位的表达不显著（P>0.05）。ULK1基因在限饲组小肠组织中的表达极显著高于其在对照组相同部位的表达（P<0.01）；Beclin1基因在限饲组小肠组织中的表达显著高于其在对照组相同部位的表达（P<0.05）。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1材料与方法4
1.1试验材料 4
1.1.1试验动物 4
1.1.2主要试剂盒与试剂 4
1.1.3试验仪器 5
1.2试验设计 5
1.3样品采集 5
1.4肠道相关基因表达的测定 5
1.4.1引物设计与合成 5
1.4.2总RNA的提取 5
1.4.3 RNA浓度检测 6
1.4.4 cDNA合成 6
1.4.2 RealTime PCR 6
1.5数据处理 6
2结果与分析6
2.1孕期母鼠日粮限饲对仔鼠初生重及血糖的影响6
2.2孕期母鼠日粮限饲对新生仔鼠组织器官重量的影响6
2.3孕期母鼠日粮限饲对新生仔鼠小肠组织自噬基因表达的影响7
2.4 孕期母鼠日粮限饲对新生仔鼠小肠组织mTOR通路关键基因表达的影响7
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
3讨论 8
3.1孕期母鼠日粮限饲对仔鼠初生重及血糖的影响8
3.2孕期母鼠日粮限饲对新生仔鼠组织器官重量的影响8
3.3孕期母鼠日粮限饲对新生仔鼠小肠组织自噬基因表达的影响8
3.4 孕期母鼠日粮限饲对新生仔鼠小肠组织mTOR通路关键基因表达的影响9
致谢9
参考文献9
母体营养限饲对新生仔鼠小肠自噬的影响
动物科学 林楠
引言
自噬是一种细胞利用溶酶体降解体内过多或异常蛋白质的机制[1]。自噬是真核细胞中普遍存在的一种生命现象，又被称 II 型程序性死亡。当细胞受到多种不良因素影响时，例如诸如营养缺乏、损伤等，细胞产生应激反应以抵抗不良因素的影响，是一种维持内稳态和适应应激反应的重要的保护机制。自然条件下，细胞内自噬水平较低，只有在应激条件发生时，自噬才会发挥其作用。
当今，经过深入的研究，人们已初步掌握自噬的发生过程及机制。目前，已初步鉴定出37种自噬相关基因，被统一命名为自噬相关基因ATG。随着自噬的检测方法不断问世，人们对自噬的了解也逐步深入。目前，常用自噬检测方法为有：电镜检测自噬体结构、底物蛋白p62的表达水平、GFPLC3 荧光染色分析以及LC3I向LC3II的转化分析。但这些方式各有其局限性，电镜检测是指在电镜下观察自噬体的双层膜结构，但如何准确判断双层膜结构是其技术难点；底物蛋白p62的表达水平与自噬活性呈负相关，由于自噬系统对底物具有特异选择性，所以通过检测特异性的自噬降解底物来标记自噬成为一项重要的自噬检测技术, 研究表明，细胞内p62/SQSTM1 的表达水平与多种自噬相关因子关系密切[2]，但p62的降解途径是否仅有自噬这一途径尚不确定；GFPLC3荧光染色分析是指经GFP转染LC3，在荧光显微镜下观察高亮的自噬泡、对自噬进行定量分析，但这种方法无法鉴别GFPLC3 异常蓄积和真正的自噬体；LC3I向LC3II的转化分析是指LC3I经泛素样加工修饰形成LC3II[3]，LC3的形式转变易导致自噬的假阳性预测；Satoshi Tsuyuki[4]等研究表明，WIPI1基因的mRNA水平表达情况可能是检测自噬的一条方便的途径，且适用于更广泛的范围。因此，本试验对WIPI1自噬基相关因进行了定量分析。然而，方法各有其局限性，尚未发现可以在任何情况下均可作为检测自噬的标准方法，因此，通常采用多种方法结合的方式对自噬做出综合判断。
自噬可以通过mTOR信号通路进行调控。雷帕霉素靶蛋白（TOR）是一种进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，TOR有两个不同功能的复合体，分别为TORC1和TORC2，在哺乳动物中为mTORC1和mTORC2，在自噬过程中主要起调节作用的是前者。ULK1（哺乳动物中Atg13的同系物）是自噬启动过程中的关键基因，它能与Atg13和FIP200（哺乳动物中Atg17的同系物）结合形成复合物ULK1Atg13FIP200。在营养充足时，mTORC1激活，与ULK1Atg13FIP200复合物结合，抑制自噬；在营养不足或雷帕霉素处理时，mTORC1活性被抑制，与ULK1Atg13FIP200复合物分离，从而诱导自噬发生[5]。Kim[6]等研究表明，mTOR对自噬的调控主要体现在对调节ULK1的生成诱导细胞自噬。Ryan[7]等研究表明ULK1使Beclin1 Ser14作用位点去磷酸化以诱导自噬。因此，通过测定ULK1和Beclin1的表达量可以推测是通过mTOR通路调节自噬的。
通过限制母体营养供给，将导致宫内发育迟缓。妊娠母体营养缺乏不仅限制了其供给胎儿营养物质的量,而且限制了胎盘的生长和功能,从而影响了胎儿的生长发育。尽管已发现宫内发育迟缓可导致小肠组织自噬体数增加以及引起母体内仔鼠肠道组织自噬增强，但孕期营养限饲对仔鼠小肠组织自噬的影响尚及相关机制的研究尚未见报道。本论文以自噬为切入点比基因和蛋白水平系统研究营养限饲对仔鼠小肠组织的影响，并从自噬通路研究其相关机制，为宫内发育迟缓肠道损伤机制的研究及营养调控提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物
试验所用大鼠购入后于扬州大学动物实验中心，环境温暖安静、避光强，自由饮水。本研究严格按照国家动物管理条例及实施细则进行试验操作。
1.1.2 主要试剂盒与试剂
PBS缓冲液购自Gibco公司，Trizol购自Invitrogen公司，DEPC、Na2EDTA?2H2O、购自南京鼎国公司，SYBR Premix Ex Taq为购自罗氏公司，DNA Marker、premix Taq Version、RNA反转录试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司，琼脂糖购自景同晖有限公司。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1材料与方法4
1.1试验材料 4
1.1.1试验动物 4
1.1.2主要试剂盒与试剂 4
1.1.3试验仪器 5
1.2试验设计 5
1.3样品采集 5
1.4肠道相关基因表达的测定 5
1.4.1引物设计与合成 5
1.4.2总RNA的提取 5
1.4.3 RNA浓度检测 6
1.4.4 cDNA合成 6
1.4.2 RealTime PCR 6
1.5数据处理 6
2结果与分析6
2.1孕期母鼠日粮限饲对仔鼠初生重及血糖的影响6
2.2孕期母鼠日粮限饲对新生仔鼠组织器官重量的影响6
2.3孕期母鼠日粮限饲对新生仔鼠小肠组织自噬基因表达的影响7
2.4 孕期母鼠日粮限饲对新生仔鼠小肠组织mTOR通路关键基因表达的影响7
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
3讨论 8
3.1孕期母鼠日粮限饲对仔鼠初生重及血糖的影响8
3.2孕期母鼠日粮限饲对新生仔鼠组织器官重量的影响8
3.3孕期母鼠日粮限饲对新生仔鼠小肠组织自噬基因表达的影响8
3.4 孕期母鼠日粮限饲对新生仔鼠小肠组织mTOR通路关键基因表达的影响9
致谢9
参考文献9
母体营养限饲对新生仔鼠小肠自噬的影响
动物科学 林楠
引言
自噬是一种细胞利用溶酶体降解体内过多或异常蛋白质的机制[1]。自噬是真核细胞中普遍存在的一种生命现象，又被称 II 型程序性死亡。当细胞受到多种不良因素影响时，例如诸如营养缺乏、损伤等，细胞产生应激反应以抵抗不良因素的影响，是一种维持内稳态和适应应激反应的重要的保护机制。自然条件下，细胞内自噬水平较低，只有在应激条件发生时，自噬才会发挥其作用。
当今，经过深入的研究，人们已初步掌握自噬的发生过程及机制。目前，已初步鉴定出37种自噬相关基因，被统一命名为自噬相关基因ATG。随着自噬的检测方法不断问世，人们对自噬的了解也逐步深入。目前，常用自噬检测方法为有：电镜检测自噬体结构、底物蛋白p62的表达水平、GFPLC3 荧光染色分析以及LC3I向LC3II的转化分析。但这些方式各有其局限性，电镜检测是指在电镜下观察自噬体的双层膜结构，但如何准确判断双层膜结构是其技术难点；底物蛋白p62的表达水平与自噬活性呈负相关，由于自噬系统对底物具有特异选择性，所以通过检测特异性的自噬降解底物来标记自噬成为一项重要的自噬检测技术, 研究表明，细胞内p62/SQSTM1 的表达水平与多种自噬相关因子关系密切[2]，但p62的降解途径是否仅有自噬这一途径尚不确定；GFPLC3荧光染色分析是指经GFP转染LC3，在荧光显微镜下观察高亮的自噬泡、对自噬进行定量分析，但这种方法无法鉴别GFPLC3 异常蓄积和真正的自噬体；LC3I向LC3II的转化分析是指LC3I经泛素样加工修饰形成LC3II[3]，LC3的形式转变易导致自噬的假阳性预测；Satoshi Tsuyuki[4]等研究表明，WIPI1基因的mRNA水平表达情况可能是检测自噬的一条方便的途径，且适用于更广泛的范围。因此，本试验对WIPI1自噬基相关因进行了定量分析。然而，方法各有其局限性，尚未发现可以在任何情况下均可作为检测自噬的标准方法，因此，通常采用多种方法结合的方式对自噬做出综合判断。
自噬可以通过mTOR信号通路进行调控。雷帕霉素靶蛋白（TOR）是一种进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，TOR有两个不同功能的复合体，分别为TORC1和TORC2，在哺乳动物中为mTORC1和mTORC2，在自噬过程中主要起调节作用的是前者。ULK1（哺乳动物中Atg13的同系物）是自噬启动过程中的关键基因，它能与Atg13和FIP200（哺乳动物中Atg17的同系物）结合形成复合物ULK1Atg13FIP200。在营养充足时，mTORC1激活，与ULK1Atg13FIP200复合物结合，抑制自噬；在营养不足或雷帕霉素处理时，mTORC1活性被抑制，与ULK1Atg13FIP200复合物分离，从而诱导自噬发生[5]。Kim[6]等研究表明，mTOR对自噬的调控主要体现在对调节ULK1的生成诱导细胞自噬。Ryan[7]等研究表明ULK1使Beclin1 Ser14作用位点去磷酸化以诱导自噬。因此，通过测定ULK1和Beclin1的表达量可以推测是通过mTOR通路调节自噬的。
通过限制母体营养供给，将导致宫内发育迟缓。妊娠母体营养缺乏不仅限制了其供给胎儿营养物质的量,而且限制了胎盘的生长和功能,从而影响了胎儿的生长发育。尽管已发现宫内发育迟缓可导致小肠组织自噬体数增加以及引起母体内仔鼠肠道组织自噬增强，但孕期营养限饲对仔鼠小肠组织自噬的影响尚及相关机制的研究尚未见报道。本论文以自噬为切入点比基因和蛋白水平系统研究营养限饲对仔鼠小肠组织的影响，并从自噬通路研究其相关机制，为宫内发育迟缓肠道损伤机制的研究及营养调控提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物
试验所用大鼠购入后于扬州大学动物实验中心，环境温暖安静、避光强，自由饮水。本研究严格按照国家动物管理条例及实施细则进行试验操作。
1.1.2 主要试剂盒与试剂
PBS缓冲液购自Gibco公司，Trizol购自Invitrogen公司，DEPC、Na2EDTA?2H2O、购自南京鼎国公司，SYBR Premix Ex Taq为购自罗氏公司，DNA Marker、premix Taq Version、RNA反转录试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司，琼脂糖购自景同晖有限公司。
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