两株h9n2亚型禽流感病毒的分离鉴定及对鸡致病特性研究
近来，临床调查研究发现，H9N2亚型禽流感病毒对鸡的致病性有增强的趋势，感染鸡发病时程短，症状严重。本研究从山东地区临床发病鸡的组织中分离禽流感病毒，采用RT-PCR技术鉴定其亚型，并通过感染无特定病原（SPF）鸡研究其致病性。结果表明，三份临床样本中，有两份感染H9N2亚型禽流感，基因序列分析发现分离毒株均为近年来占优势地位的G57基因型。此外，将两株病毒对SPF鸡鼻腔攻毒发现，不仅在气管和肺，病毒还能在肠、脾、肾等多器官高效复制。在感染SPF鸡后，两个攻毒组均能在鸡的口腔中检测到病毒，同居组出现感染时间长，比例高。这些数据说明，新近出现的H9N2病毒对鸡致病力增强，这提示我们必须重视对H9N2病毒进化和变异的监测，加强对H9N2病毒的防控。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 3
第一章 H9N2流感病毒的分离鉴定及基因序列分析 4
1 材料与方法 4
1．1 材料 4
1．2 方法 5
2 结果与分析 8
2．1 血凝及血凝抑制试验 8
2．2 PCR鉴定及测序结果 8
2．3 H9N2分离株的测序 9
2．4 系统进化树分析 9
2．5 病毒关键性氨基酸位点分析 13
3 讨论 14
第二章 两株H9N2流感病毒对鸡的致病力分析 15
1 材料与方法 15
1．1 材料 15
1．2 方法 15
2 结果与分析 16
2．1 SPF鸡IVPI实验 16
2．2 鸡的致病性实验 17
2．2 鸡的传播性实验 20
3 讨论 20
致谢 23
参考文献 25
两株H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及对鸡致病特性研究
引言
流行性感冒是由正黏病毒科A型流感病毒引起的急性呼吸道感染或综合征。根据血凝素（Hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（Neuramin *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
idase，NA）表面抗原，可将病毒分为许多不同的亚型。禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）变异频繁，已在全世界范围内广泛地流行，可根据其致病性分为高致病性禽流感病毒、低致病性禽流感病毒与无致病性禽流感病毒[1]
流感病毒的基因组为单股负链RNA，分为8个基因片段，分别以片段18来命名，每个片段各自独立复制，主要编码11种蛋白，依次组成聚合酶复合体的PB2、PB1、PA，血凝素（HA）、病毒核衣壳蛋白（NP）、神经氨酸酶（NA）、基质蛋白1和2（M1、M2）、非结构蛋白1和2（NS1、NS2）。
其中，片段4是流感病毒基因组中最容易发生变异的一个片段，不同亚型或同一亚型不同毒株之间其序列存在明显差异。HA蛋白是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一，是所有流感病毒蛋白中最重要的一个。HA主要功能包括结合宿主唾液酸之类的细胞受体[2]，在病毒吸附和穿膜过程中起关键作用。HA上裂解位点的序列直接影响AIV的致病性[3]。HA的变异是流感病毒抗原性改变的主要原因。此外，片段6容易发生缺失，其长度在不同毒株间可能存在差异。片段6编码的NA也是囊膜糖蛋白，是流感病毒粒子表面的另一重要抗原。NA的主要功能是避免子代病毒粒子的自我聚集，有利于病毒粒子的成熟与释放[4]。
1966年，H9N2亚型禽流感病毒在美国威斯康辛州的火鸡中首次分离 [5]。在我国大陆地区，1994年陈伯伦等[6]首次从广东某鸡场发病鸡体内分离到6株H9N2亚型禽流感病毒。香港大学和中国农业科学院哈尔滨兽医研究所等单位发表的监测数据显示，H9N2亚型流感病毒在我国长期流行，且宿主范围广泛，包括鸡、鸭、珍珠鸡、鹌鹑等[7]。H9N2现今已成为我国禽类养殖中，危害较大的一种传染病。2013年以来，在我国出现的新型H7N9亚型和H10N8亚型病毒，其内部基因均来自H9N2亚型病毒[8]。
H9N2亚型禽流感病毒为低致病性禽流感病毒，在养殖环境下，通常不会致死，但是可引起鸡呼吸困难、腹泻、产蛋下降等症状，当继发细菌感染时，可引起部分病鸡的死亡。接种SPF鸡，一般不表现临床症状，或表现出轻微的临床症状，但通常不能引起明显的组织病变[9]。有临床调查研究显示，近年H9N2有毒力增强的趋势。目前，已有研究统计分析了近些年来临床分离的H9N2亚型禽流感病毒，结果发现，部分分离株对鸡和鸡胚的致病性显著增强。强致病力毒株在鸡体内复制力强、排毒时间长，且可以造成鸡系统性感染。接种鸡胚后，能够致死鸡胚[10]。H9N2在我国分布广泛，从我国鸡场中的分离比率逐年上升，若这种强致病力H9N2毒株的出现，会对养禽业和公共卫生均构成威胁。
本实验选取2份来自山东两个地区临床发病鸡组织接种鸡胚后收获的尿囊液，分离病毒进行全基因组序列分析，并测定了这两个毒株的对SPF鸡致病指数，体内的复制和排毒情况以及在鸡之间的传播能力，以研究H9N2亚型毒株的致病力。
第一章 H9N2流感病毒的分离鉴定及基因序列分析
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 病毒
本研究中所用病毒由本实验室分离所得，来源于中国山东地区临沂和烟台送检的2份临床发病鸡病料，其接种鸡胚收获的二代尿囊液，经滤器过滤后分装于冻存管，80(C保存。
1．1．2 序列
从National Center for Biotechnology Information (NCBI) 的流感序列数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database）和Influenza Research Database数据库（http://www.fludb.org/brc/home.spg?decorator=influenza）中下载H9N2的病毒序列进行比对分析。
1．1．3 试剂
1．1．3．1 购买试剂
TRIzol（Invitrogen，货号，15596026）、HiScriptⅡ1st Strand Cdna Synthesis Kit（Vazyme，货号，R11101/02）、GoldenView（北京索莱宝，货号，G8140）、Trans5K DNA Marker、2×Taq Mix（北京全式金，货号，BM14101，PM001H）
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 3
第一章 H9N2流感病毒的分离鉴定及基因序列分析 4
1 材料与方法 4
1．1 材料 4
1．2 方法 5
2 结果与分析 8
2．1 血凝及血凝抑制试验 8
2．2 PCR鉴定及测序结果 8
2．3 H9N2分离株的测序 9
2．4 系统进化树分析 9
2．5 病毒关键性氨基酸位点分析 13
3 讨论 14
第二章 两株H9N2流感病毒对鸡的致病力分析 15
1 材料与方法 15
1．1 材料 15
1．2 方法 15
2 结果与分析 16
2．1 SPF鸡IVPI实验 16
2．2 鸡的致病性实验 17
2．2 鸡的传播性实验 20
3 讨论 20
致谢 23
参考文献 25
两株H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及对鸡致病特性研究
引言
流行性感冒是由正黏病毒科A型流感病毒引起的急性呼吸道感染或综合征。根据血凝素（Hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（Neuramin *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
idase，NA）表面抗原，可将病毒分为许多不同的亚型。禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）变异频繁，已在全世界范围内广泛地流行，可根据其致病性分为高致病性禽流感病毒、低致病性禽流感病毒与无致病性禽流感病毒[1]
流感病毒的基因组为单股负链RNA，分为8个基因片段，分别以片段18来命名，每个片段各自独立复制，主要编码11种蛋白，依次组成聚合酶复合体的PB2、PB1、PA，血凝素（HA）、病毒核衣壳蛋白（NP）、神经氨酸酶（NA）、基质蛋白1和2（M1、M2）、非结构蛋白1和2（NS1、NS2）。
其中，片段4是流感病毒基因组中最容易发生变异的一个片段，不同亚型或同一亚型不同毒株之间其序列存在明显差异。HA蛋白是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一，是所有流感病毒蛋白中最重要的一个。HA主要功能包括结合宿主唾液酸之类的细胞受体[2]，在病毒吸附和穿膜过程中起关键作用。HA上裂解位点的序列直接影响AIV的致病性[3]。HA的变异是流感病毒抗原性改变的主要原因。此外，片段6容易发生缺失，其长度在不同毒株间可能存在差异。片段6编码的NA也是囊膜糖蛋白，是流感病毒粒子表面的另一重要抗原。NA的主要功能是避免子代病毒粒子的自我聚集，有利于病毒粒子的成熟与释放[4]。
1966年，H9N2亚型禽流感病毒在美国威斯康辛州的火鸡中首次分离 [5]。在我国大陆地区，1994年陈伯伦等[6]首次从广东某鸡场发病鸡体内分离到6株H9N2亚型禽流感病毒。香港大学和中国农业科学院哈尔滨兽医研究所等单位发表的监测数据显示，H9N2亚型流感病毒在我国长期流行，且宿主范围广泛，包括鸡、鸭、珍珠鸡、鹌鹑等[7]。H9N2现今已成为我国禽类养殖中，危害较大的一种传染病。2013年以来，在我国出现的新型H7N9亚型和H10N8亚型病毒，其内部基因均来自H9N2亚型病毒[8]。
H9N2亚型禽流感病毒为低致病性禽流感病毒，在养殖环境下，通常不会致死，但是可引起鸡呼吸困难、腹泻、产蛋下降等症状，当继发细菌感染时，可引起部分病鸡的死亡。接种SPF鸡，一般不表现临床症状，或表现出轻微的临床症状，但通常不能引起明显的组织病变[9]。有临床调查研究显示，近年H9N2有毒力增强的趋势。目前，已有研究统计分析了近些年来临床分离的H9N2亚型禽流感病毒，结果发现，部分分离株对鸡和鸡胚的致病性显著增强。强致病力毒株在鸡体内复制力强、排毒时间长，且可以造成鸡系统性感染。接种鸡胚后，能够致死鸡胚[10]。H9N2在我国分布广泛，从我国鸡场中的分离比率逐年上升，若这种强致病力H9N2毒株的出现，会对养禽业和公共卫生均构成威胁。
本实验选取2份来自山东两个地区临床发病鸡组织接种鸡胚后收获的尿囊液，分离病毒进行全基因组序列分析，并测定了这两个毒株的对SPF鸡致病指数，体内的复制和排毒情况以及在鸡之间的传播能力，以研究H9N2亚型毒株的致病力。
第一章 H9N2流感病毒的分离鉴定及基因序列分析
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 病毒
本研究中所用病毒由本实验室分离所得，来源于中国山东地区临沂和烟台送检的2份临床发病鸡病料，其接种鸡胚收获的二代尿囊液，经滤器过滤后分装于冻存管，80(C保存。
1．1．2 序列
从National Center for Biotechnology Information (NCBI) 的流感序列数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database）和Influenza Research Database数据库（http://www.fludb.org/brc/home.spg?decorator=influenza）中下载H9N2的病毒序列进行比对分析。
1．1．3 试剂
1．1．3．1 购买试剂
TRIzol（Invitrogen，货号，15596026）、HiScriptⅡ1st Strand Cdna Synthesis Kit（Vazyme，货号，R11101/02）、GoldenView（北京索莱宝，货号，G8140）、Trans5K DNA Marker、2×Taq Mix（北京全式金，货号，BM14101，PM001H）
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