猪支原体肺炎疫苗佐剂保存期小鼠体内免疫研究
：本研究旨在通过对猪支原体肺炎活疫苗及灭活疫苗的两种水佐剂的稳定性进行评价，为疫苗产品的开发提供理论数据。试验利用小鼠模型进行体内免疫评价，使用了在不同温度下保存了不同时间的佐剂配制猪支原体肺炎活疫苗及灭活疫苗，疫苗肌肉注射免疫小鼠2次，采用间接ELISA测定血清IgG抗体评价免疫效果。试验结果表明灭活苗佐剂在4℃存放12个月或37℃存放2周；活苗佐剂在4℃存放28个月或37℃存放2周后佐剂物理外观无变化，佐剂免疫效力无显著差异，佐剂稳定性良好。研究结果可为疫苗研发提供一定参考。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1 试验材料 4
1.1.1 佐剂成分4
1.1.2 实验动物4
1.1.3 疫苗4
1.1.4 主要试剂5
1.1.5 主要仪器5
1.2 试验方法 5
1.2.1 灭活疫苗免疫方法5
1.2.2 活疫苗免疫方法5
1.2.3 血清采样5
1.2.4 血清抗体水平的测定5
1.2.5 数据处理5
2 结果与分析6
2.1 灭活苗佐剂物理外观6
2.2 活苗佐剂物理外观6
2.3 灭活苗免疫后血清抗体检查6
2.4 活苗免疫后血清抗体检查7
3 讨论8
致谢8
参考文献9
猪支原体肺炎疫苗佐剂保存期小鼠体内免疫研究
引言
猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp）引起的一种猪的慢性呼吸道传染病。我国最早于二十世纪四十年代发现此病，近些年来，此病有愈演愈烈的趋势，已成为严重威胁养猪业发展的疾病之一。该病死亡率低，但发病率高，且难以根除。典型的猪支原体肺炎的临床症状主要表现出干咳和气喘，病猪常见食欲不振，生长缓慢，严重影响猪场经济效益[13]。
目前猪场主要通过疫苗免疫、药物治疗以及环境控制这三个方面来防控猪气喘病，其中优质有效的
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
疫苗对猪群进行预防免疫是控制该病的核心[45]，据相关文献报道，国外已成功通过免疫控制净化猪气喘病。现阶段猪气喘病疫苗主要以进口灭活苗为主，国内的168弱毒疫苗有效减少猪群呼吸道综合征临床症状，也占有一定的市场份额[67]。
佐剂作为疫苗产品的关键成份之一，直接影响疫苗免疫的效果。佐剂（adjuvant）又叫免疫增强剂（Immunopotentiator），是先于抗原或与抗原同时应用，能增强机体对抗原非特异性免疫应答能力的物质。多年来试验研究证实，添加佐剂可以辅助抗原增强它们免疫应答的能力，其对疫苗的免疫效果有正向帮助作用。关于佐剂的作用机制一般研究认为有5点，即免疫调节作用、抗原提呈作用、抗原贮存、靶向作用及诱导CD8+细胞毒性T细胞（CTL）应答[812]。通常，佐剂主要用于辅佐灭活疫苗或者重组疫苗，较少与活疫苗配合使用，相较于不能在机体内生长繁殖的灭活疫苗，一般弱毒活疫苗具有更高的免疫效力，对机体的免疫刺激时间也更加长效。但是，某些活疫苗其本身的免疫刺激能力不够强，或者在特定条件下不足以激发机体产生有效的免疫应答，因此仍需要使用佐剂进行免疫。如Rauw等利用壳聚糖作为新城疫活疫苗佐剂以鼻腔给药途径对一日龄鸡进行免疫，证明壳聚糖可通过Th1型反应增强疫苗对动物的保护效果[13]。
本研究着重对猪支原体肺炎活疫苗及灭活疫苗的两种水佐剂的稳定性进行评价，为疫苗产品的开发提供基本数据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1佐剂成分
1.1.1.1灭活苗佐剂
表1 灭活疫苗佐剂
Table 1 Inactivated vaccine adjuvant
组别
佐剂成分
佐剂名称
存放条件
存放时长
G1组
—
阴性对照组
—
—
G2组
佐剂1
新鲜配制佐剂对照组
4度
—
G3组
佐剂1
待检组1
4度
12月
G4组
佐剂1
待检组2
37度
2周
1.1.1.2活苗佐剂
表2 活疫苗佐剂
Table 2 Live vaccine adjuvant
组号
佐剂成分
佐剂名称
存放条件
存放时长
G1组
—
阴性对照组
—
—
G2组
佐剂2
新鲜配制佐剂对照组
4度
—
G3组
佐剂2
待检组1
4度
28月
G4组
佐剂2
待检组2
4度
18月
G5组
佐剂2
待检组3
4度
18月
G6组
佐剂2
待检组4
4度
成分1配好16月后
新鲜配制成佐剂2
G7组
佐剂2
待检组5
37度
2周
1.1.2实验动物
1820g的雄性昆明小鼠80只，45周龄，购自青龙山小鼠点。
1.1.3疫苗
1.1.3.1灭活苗抗原
猪支原体肺炎灭活疫苗抗原（NJ株）：由江苏省农业科学院兽医所研制。
1.1.3.2活苗抗原
猪支原体肺炎活疫苗（168株）：由江苏省农业科学院兽医所研制。
1.1.4主要试剂
HRP羊抗鼠IgG：武汉博士德生物工程有限公司
猪肺炎支原体全菌蛋白；灭活苗佐剂(佐剂1)；活苗佐剂(佐剂2)：本实验室提供；
1.1.5主要仪器
DNP9052型电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；
ELx800吸光酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；
Thermo Scientific SL16R台式冷冻离心机，美国Thermo Scientific公司；
1.2试验方法
1.2.1灭活疫苗免疫方法
将小鼠随机分成10组，每组8只，分笼编号。第一组G1作为阴性对照，其余9组作为实验组。对灭活苗组G24组进行灭活疫苗免疫。取猪支原体肺炎灭活疫苗1ml（1ml含3×109CCU)用2.75ml无菌PBS稀释，将溶液倒入一个空的100ml瓶中此时1ml疫苗含量为8×108CCU，然后取出疫苗溶液1ml与1ml不同条件下保存的佐剂1混合加入小青瓶中，最后得到2ml疫苗溶液（含4×108CCU），此为13只动物的一次免疫剂量，每只动物免疫150 μl 即107CCU。注射方式为左右后腿肌肉注射。动物免疫2次，于首次免疫后2周再次免疫。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1 试验材料 4
1.1.1 佐剂成分4
1.1.2 实验动物4
1.1.3 疫苗4
1.1.4 主要试剂5
1.1.5 主要仪器5
1.2 试验方法 5
1.2.1 灭活疫苗免疫方法5
1.2.2 活疫苗免疫方法5
1.2.3 血清采样5
1.2.4 血清抗体水平的测定5
1.2.5 数据处理5
2 结果与分析6
2.1 灭活苗佐剂物理外观6
2.2 活苗佐剂物理外观6
2.3 灭活苗免疫后血清抗体检查6
2.4 活苗免疫后血清抗体检查7
3 讨论8
致谢8
参考文献9
猪支原体肺炎疫苗佐剂保存期小鼠体内免疫研究
引言
猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp）引起的一种猪的慢性呼吸道传染病。我国最早于二十世纪四十年代发现此病，近些年来，此病有愈演愈烈的趋势，已成为严重威胁养猪业发展的疾病之一。该病死亡率低，但发病率高，且难以根除。典型的猪支原体肺炎的临床症状主要表现出干咳和气喘，病猪常见食欲不振，生长缓慢，严重影响猪场经济效益[13]。
目前猪场主要通过疫苗免疫、药物治疗以及环境控制这三个方面来防控猪气喘病，其中优质有效的
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疫苗对猪群进行预防免疫是控制该病的核心[45]，据相关文献报道，国外已成功通过免疫控制净化猪气喘病。现阶段猪气喘病疫苗主要以进口灭活苗为主，国内的168弱毒疫苗有效减少猪群呼吸道综合征临床症状，也占有一定的市场份额[67]。
佐剂作为疫苗产品的关键成份之一，直接影响疫苗免疫的效果。佐剂（adjuvant）又叫免疫增强剂（Immunopotentiator），是先于抗原或与抗原同时应用，能增强机体对抗原非特异性免疫应答能力的物质。多年来试验研究证实，添加佐剂可以辅助抗原增强它们免疫应答的能力，其对疫苗的免疫效果有正向帮助作用。关于佐剂的作用机制一般研究认为有5点，即免疫调节作用、抗原提呈作用、抗原贮存、靶向作用及诱导CD8+细胞毒性T细胞（CTL）应答[812]。通常，佐剂主要用于辅佐灭活疫苗或者重组疫苗，较少与活疫苗配合使用，相较于不能在机体内生长繁殖的灭活疫苗，一般弱毒活疫苗具有更高的免疫效力，对机体的免疫刺激时间也更加长效。但是，某些活疫苗其本身的免疫刺激能力不够强，或者在特定条件下不足以激发机体产生有效的免疫应答，因此仍需要使用佐剂进行免疫。如Rauw等利用壳聚糖作为新城疫活疫苗佐剂以鼻腔给药途径对一日龄鸡进行免疫，证明壳聚糖可通过Th1型反应增强疫苗对动物的保护效果[13]。
本研究着重对猪支原体肺炎活疫苗及灭活疫苗的两种水佐剂的稳定性进行评价，为疫苗产品的开发提供基本数据。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1佐剂成分
1.1.1.1灭活苗佐剂
表1 灭活疫苗佐剂
Table 1 Inactivated vaccine adjuvant
组别
佐剂成分
佐剂名称
存放条件
存放时长
G1组
—
阴性对照组
—
—
G2组
佐剂1
新鲜配制佐剂对照组
4度
—
G3组
佐剂1
待检组1
4度
12月
G4组
佐剂1
待检组2
37度
2周
1.1.1.2活苗佐剂
表2 活疫苗佐剂
Table 2 Live vaccine adjuvant
组号
佐剂成分
佐剂名称
存放条件
存放时长
G1组
—
阴性对照组
—
—
G2组
佐剂2
新鲜配制佐剂对照组
4度
—
G3组
佐剂2
待检组1
4度
28月
G4组
佐剂2
待检组2
4度
18月
G5组
佐剂2
待检组3
4度
18月
G6组
佐剂2
待检组4
4度
成分1配好16月后
新鲜配制成佐剂2
G7组
佐剂2
待检组5
37度
2周
1.1.2实验动物
1820g的雄性昆明小鼠80只，45周龄，购自青龙山小鼠点。
1.1.3疫苗
1.1.3.1灭活苗抗原
猪支原体肺炎灭活疫苗抗原（NJ株）：由江苏省农业科学院兽医所研制。
1.1.3.2活苗抗原
猪支原体肺炎活疫苗（168株）：由江苏省农业科学院兽医所研制。
1.1.4主要试剂
HRP羊抗鼠IgG：武汉博士德生物工程有限公司
猪肺炎支原体全菌蛋白；灭活苗佐剂(佐剂1)；活苗佐剂(佐剂2)：本实验室提供；
1.1.5主要仪器
DNP9052型电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；
ELx800吸光酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；
Thermo Scientific SL16R台式冷冻离心机，美国Thermo Scientific公司；
1.2试验方法
1.2.1灭活疫苗免疫方法
将小鼠随机分成10组，每组8只，分笼编号。第一组G1作为阴性对照，其余9组作为实验组。对灭活苗组G24组进行灭活疫苗免疫。取猪支原体肺炎灭活疫苗1ml（1ml含3×109CCU)用2.75ml无菌PBS稀释，将溶液倒入一个空的100ml瓶中此时1ml疫苗含量为8×108CCU，然后取出疫苗溶液1ml与1ml不同条件下保存的佐剂1混合加入小青瓶中，最后得到2ml疫苗溶液（含4×108CCU），此为13只动物的一次免疫剂量，每只动物免疫150 μl 即107CCU。注射方式为左右后腿肌肉注射。动物免疫2次，于首次免疫后2周再次免疫。
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