新城疫病毒纯化方法的比较分析
新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是引起禽类的一种高度致病的急性传染病。目前，实验室研究NDV主要通过鸡胚扩增培养，然而，获得纯度较高的新城疫病毒十分困难，常见的病毒分离方法有沉淀法、离心法、透析法。本研究拟采用蔗糖密度梯度离心法(sucrose density gradient centrifugation，SDGC)和红细胞吸附释放法(absorption and release-RBC，A R-RBC)纯化鸡胚尿囊液中的NDV，测定血凝效价，通过考马斯蓝染色法（coomassie blue staining）及蛋白质印迹（Western-blot）检测NDV纯化效率，以评估SDGC与AR-RBC对NDV纯化的优劣。结果表明，SDGC法纯化NDV较AR-RBC法纯化NDV蛋白浓度高，而采用红细胞吸附释放法纯化新城疫病毒时，醛化红细胞较新鲜红细胞不易出现溶血现象。结论，利用SDGC法纯化NDV较AR-RBC效果好，醛化红细胞较新鲜红细胞纯化效果好。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key Words 1
引言 2
1材料和方法 2
1.1 毒株 2
1.2 红细胞 2
1.3 SPF鸡胚 3
1.4 实验试剂 3
1.5 试剂配方 3
1.6 仪器与设备 3
1.7 病毒增殖 4
1.8 新鲜红细胞吸附释放法纯化新城疫病毒 4
1.8.1新鲜红细胞吸附释放NDV 4
1.8.2 利用考马斯亮蓝快速染色及Westernblot鉴定纯化效率 4
1.9 50% 醛化红细胞吸附释放法纯化新城疫病毒 5
1.9.1 制备50% 醛化红细胞 5
1.9.2 50% 醛化红细胞吸附NDV 5
1.9.3 50% 醛化红细胞释放NDV 5
1.9.4 处理醛化红细胞释放后的病毒液 5
1.9.5 鉴定纯化效率 5
1.10 蔗糖梯度离心纯化病毒 5
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
1.10.1 超速浓缩蔗糖梯度密度纯化 5
1.10.2鉴定病毒纯化效率 6
2 结果与分析 6
2.1 50% 醛化红细胞吸附释放法纯化新城疫病毒 6
2.2 SDSPAGE考马斯亮蓝染色法检测NDV纯化效率 7
2.3 蔗糖密度梯度离心法纯化NDV 7
3讨论 10
致谢 12
参考文献 13
新城疫病毒纯化方法的比较分析
引言
新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一种高度接触性的急性传染病，主要感染禽类。该病病变多出现于消化道和呼吸道，以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征[1]。其发病率和死亡率极高，给养禽行业带来了极大的不良影响。新城疫病毒属于副粘病毒科、腮腺炎病毒属、禽I型副粘病毒中的成员。其完整的病毒形态是一个有囊膜包被的近似球星的颗粒物，直径约为100~400 nm。病毒囊膜表面覆盖有8 nm长的纤突，一个直径约为17 nm的卷曲核衣壳即为病毒粒子的内部构成。
鸡胚扩增培养病毒，产量高，操作简便，成本低廉，因此鸡胚扩增培养成为了实验室新城疫病毒培养最常用的方法。然而，从鸡胚尿囊液中收集的新城疫病毒液纯度较低，并且常常混杂鸡胚蛋白，由于新城疫病毒有囊膜，想除去寄生宿主蛋白而获得纯度较高的新城疫病毒十分困难[2]，因而严重影响了鸡胚扩毒的应用范围，甚至会影响实验结果。因此，鸡胚病毒液的浓缩纯化成为了开展新城疫病毒的生物学特性，免疫学特性及分子生物学方面研究的前提和基础。
NDV基因编码6种病毒特异性结构蛋白，即为大分子量聚合酶蛋白（Large molecular weight polymerase protein，L）、核衣壳蛋白（Nuclear capsid protein，NP）、磷蛋白（phosphoprotein，P）、血凝素神经氨酸酶蛋白（Hemagglutinin neuraminidase proteins，HN）、融合蛋白（fusion protein，F）、基质蛋白（Matrix proteins，M）[3,4]。其中NP蛋白是组成病毒核衣壳最重要的结构蛋白，与P和L蛋白结合包裹基因组RNA形成一个螺旋的核糖体蛋白复合体[5]。NP蛋白在新城疫病毒中的含量相对较高，并且具有高度的免疫原性和保守性[3]，因此以NP蛋主蛋白而获得纯度较高的新城疫病毒十分困难[2]，因而严重影响了鸡胚扩毒的应白作为检测新城疫病毒纯化效率具有高度的稳定性。
目前，主要用于纯化病毒的方法有沉淀法、离心法和红细胞吸附法等，其中应用最广泛的方法之一即是超速离心法[6]。超速离心法中使用较多的为等密度梯度离心。蔗糖易溶于水，对核酸和蛋白质无不良影响，主要应用于等密度梯度离心。
新城疫病毒毒株能在4(C或室温条件下凝集多种哺乳类和禽类动物的红细胞，而在37(C，病毒又能很快释放出来[7,8]。根据新城疫病毒这一生物特性，可以使用红细胞吸附释放法来纯化新城疫病毒，这种方法浓缩效率较高，病毒损失少，成本低廉，是浓缩纯化病毒较好的一种方法。
本文使用了两种方法即蔗糖梯度离心法（sucrose density gradient centrifugation ，SDGC）和红细胞吸附释放法（absorption and releaseRBC ，ARRBC）纯化新城疫病毒，并对两种方法进行比较。
1材料和方法
1.1 毒株
NDV Herts/33 及La Sota株，由中国农业科学院上海兽医研究所禽病实验室提供，经复苏稀释后使用。
1.2 红细胞
由中国农业科学院上海兽医研究所禽病实验室自行制备。
1.3 SPF鸡胚
购于上海梅里亚维通生物有限公司。
1.4 实验试剂
碘酊，购于上海邦士利消毒有限公司；甲醛（10010018）、NaoH（H0245053） 、盐酸（10011008）冰醋酸（FA3550002）、蔗糖（10021418），均购于国药集团化学试剂有限公司；Nacl（A1002410500）、EDTA（A5008950500）、甲醇（A6016170500）、甘氨酸（A1001670100）、SDS（A1002270500）、TWEEN20（A1007770500）、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（A0216）均购于生工生物工程（上海）有限公司；PBS（SH30256.01B）、蛋白质分子量标准（PageRuler）（26616）为赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司的产品；Tris Base（93350）购于Sigma公司；考马斯亮蓝快速染色液（P0017）、SDSPAGE蛋白上样缓冲液（2×Loading butter）（P0015B）购于beyotime公司，Supersignal west pico Chemiluminescent Substrates试剂盒（34080）购于上海前尘生物科技有限公司；Protain，NC膜（10401396）购于上海雅裕生物科技有限公司；NP抗体（3F5）由中国农业科学院上海兽医研究所禽病实验室自行制备保存。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key Words 1
引言 2
1材料和方法 2
1.1 毒株 2
1.2 红细胞 2
1.3 SPF鸡胚 3
1.4 实验试剂 3
1.5 试剂配方 3
1.6 仪器与设备 3
1.7 病毒增殖 4
1.8 新鲜红细胞吸附释放法纯化新城疫病毒 4
1.8.1新鲜红细胞吸附释放NDV 4
1.8.2 利用考马斯亮蓝快速染色及Westernblot鉴定纯化效率 4
1.9 50% 醛化红细胞吸附释放法纯化新城疫病毒 5
1.9.1 制备50% 醛化红细胞 5
1.9.2 50% 醛化红细胞吸附NDV 5
1.9.3 50% 醛化红细胞释放NDV 5
1.9.4 处理醛化红细胞释放后的病毒液 5
1.9.5 鉴定纯化效率 5
1.10 蔗糖梯度离心纯化病毒 5
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
1.10.1 超速浓缩蔗糖梯度密度纯化 5
1.10.2鉴定病毒纯化效率 6
2 结果与分析 6
2.1 50% 醛化红细胞吸附释放法纯化新城疫病毒 6
2.2 SDSPAGE考马斯亮蓝染色法检测NDV纯化效率 7
2.3 蔗糖密度梯度离心法纯化NDV 7
3讨论 10
致谢 12
参考文献 13
新城疫病毒纯化方法的比较分析
引言
新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一种高度接触性的急性传染病，主要感染禽类。该病病变多出现于消化道和呼吸道，以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征[1]。其发病率和死亡率极高，给养禽行业带来了极大的不良影响。新城疫病毒属于副粘病毒科、腮腺炎病毒属、禽I型副粘病毒中的成员。其完整的病毒形态是一个有囊膜包被的近似球星的颗粒物，直径约为100~400 nm。病毒囊膜表面覆盖有8 nm长的纤突，一个直径约为17 nm的卷曲核衣壳即为病毒粒子的内部构成。
鸡胚扩增培养病毒，产量高，操作简便，成本低廉，因此鸡胚扩增培养成为了实验室新城疫病毒培养最常用的方法。然而，从鸡胚尿囊液中收集的新城疫病毒液纯度较低，并且常常混杂鸡胚蛋白，由于新城疫病毒有囊膜，想除去寄生宿主蛋白而获得纯度较高的新城疫病毒十分困难[2]，因而严重影响了鸡胚扩毒的应用范围，甚至会影响实验结果。因此，鸡胚病毒液的浓缩纯化成为了开展新城疫病毒的生物学特性，免疫学特性及分子生物学方面研究的前提和基础。
NDV基因编码6种病毒特异性结构蛋白，即为大分子量聚合酶蛋白（Large molecular weight polymerase protein，L）、核衣壳蛋白（Nuclear capsid protein，NP）、磷蛋白（phosphoprotein，P）、血凝素神经氨酸酶蛋白（Hemagglutinin neuraminidase proteins，HN）、融合蛋白（fusion protein，F）、基质蛋白（Matrix proteins，M）[3,4]。其中NP蛋白是组成病毒核衣壳最重要的结构蛋白，与P和L蛋白结合包裹基因组RNA形成一个螺旋的核糖体蛋白复合体[5]。NP蛋白在新城疫病毒中的含量相对较高，并且具有高度的免疫原性和保守性[3]，因此以NP蛋主蛋白而获得纯度较高的新城疫病毒十分困难[2]，因而严重影响了鸡胚扩毒的应白作为检测新城疫病毒纯化效率具有高度的稳定性。
目前，主要用于纯化病毒的方法有沉淀法、离心法和红细胞吸附法等，其中应用最广泛的方法之一即是超速离心法[6]。超速离心法中使用较多的为等密度梯度离心。蔗糖易溶于水，对核酸和蛋白质无不良影响，主要应用于等密度梯度离心。
新城疫病毒毒株能在4(C或室温条件下凝集多种哺乳类和禽类动物的红细胞，而在37(C，病毒又能很快释放出来[7,8]。根据新城疫病毒这一生物特性，可以使用红细胞吸附释放法来纯化新城疫病毒，这种方法浓缩效率较高，病毒损失少，成本低廉，是浓缩纯化病毒较好的一种方法。
本文使用了两种方法即蔗糖梯度离心法（sucrose density gradient centrifugation ，SDGC）和红细胞吸附释放法（absorption and releaseRBC ，ARRBC）纯化新城疫病毒，并对两种方法进行比较。
1材料和方法
1.1 毒株
NDV Herts/33 及La Sota株，由中国农业科学院上海兽医研究所禽病实验室提供，经复苏稀释后使用。
1.2 红细胞
由中国农业科学院上海兽医研究所禽病实验室自行制备。
1.3 SPF鸡胚
购于上海梅里亚维通生物有限公司。
1.4 实验试剂
碘酊，购于上海邦士利消毒有限公司；甲醛（10010018）、NaoH（H0245053） 、盐酸（10011008）冰醋酸（FA3550002）、蔗糖（10021418），均购于国药集团化学试剂有限公司；Nacl（A1002410500）、EDTA（A5008950500）、甲醇（A6016170500）、甘氨酸（A1001670100）、SDS（A1002270500）、TWEEN20（A1007770500）、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（A0216）均购于生工生物工程（上海）有限公司；PBS（SH30256.01B）、蛋白质分子量标准（PageRuler）（26616）为赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司的产品；Tris Base（93350）购于Sigma公司；考马斯亮蓝快速染色液（P0017）、SDSPAGE蛋白上样缓冲液（2×Loading butter）（P0015B）购于beyotime公司，Supersignal west pico Chemiluminescent Substrates试剂盒（34080）购于上海前尘生物科技有限公司；Protain，NC膜（10401396）购于上海雅裕生物科技有限公司；NP抗体（3F5）由中国农业科学院上海兽医研究所禽病实验室自行制备保存。
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