利用激光共聚焦显微镜对小麦麸和大豆皮细胞壁及其消化残渣形态的观察
将利用激光共聚焦显微镜对小麦麸和大豆皮原料、由上述原料作为单一纤维来源配制的4种饲粮(分添加/未添加细胞壁降解酶)经生长猪消化后的回肠末端食糜和粪便样品中细胞壁形态、纤维素和木质素分布进行观察，考察小麦麸和大豆皮细胞壁形态和组分在动物消化过程中的变化。结果显示小麦麸细胞壁呈不规则立方体，纤维网状排列，小麦麸细胞壁呈不规则立方体，纤维网状排列；大豆皮细胞呈网格状，排列相对整齐。小麦麸细胞壁中纤维素含量较高，集中在细胞连接处；大豆皮细胞壁中纤维素含量较低，分布比较分散。两原料中均可见木质素，分布与纤维素类似。经猪肠道消化后，两种原料的细胞壁结构完整性均被明显破坏，纤维素含量下降；添加细胞壁降解酶制剂进一步降低了消化残渣中的纤维素含量，相对而言，粪便样品中变化更明显。本实验利用激光共聚焦显微镜提供了上述两种纤维性饲料原料细胞壁形态和组分在猪消化过程中变化过程的直观图像，为细胞壁组分的消化代谢研究提供参考。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1□材料与方法4
1.1□实验材料与试剂4
1.1.1□实验材料4
1.1.2□实验试剂4
1.2□实验仪器4
1.3□实验方法4
1.3.1□荧光染色步骤4
1.3.2□激光共聚焦显微镜观察参数设定5
2□结果与分析5
2.1□CLSM的观察结果5
2.1.1□小麦麸的观察结果5
2.1.2□大豆皮的观察结果7
3□讨论9
致谢10
参考文献10
利用激光共聚焦显微镜对小麦麸和大豆皮细胞壁及其消化残渣形态的观察
动物科学学生 李俊尊
引言
引言
近年来，饲料原料价格的上涨促使养殖和饲料企业积极寻找价廉物美的替代原料。小麦麸俗称麸皮，是小麦籽实为原料加工面粉后剩余的种皮、糊粉层、部分胚芽与少量胚乳的混合物，营养丰富，常被用作饲料原料。但因小麦麸中粗纤维含量较高（8.5%12.0%），但养分的消化率与有效能值较低[1]。我国 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
年产小麦1.3亿吨左右，按20%出麸率计算，小麦麸年产可达2600万吨，若提高其养分利用效率，可有效解决缓和饲料资源紧缺的局面。大豆皮是大豆脱皮制油加工过程中的副产物，主要是大豆外层包被的物质。虽然中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）的含量很高，但木质素的含量不足 2% ，这使得大豆皮的活体外干物质消化率高达90%[2]。大豆皮已然成为一种可开发利用的非常规饲料原料资源，利用好这一资源不但可以避免粮食供给压力，人畜争粮矛盾亦可缓解。
植物细胞壁是植物细胞区别于动物细胞的主要特征之一，是植物活细胞的重要组成部分，其主要成分包括纤维素、半纤维素、果胶质和木质素等。它主要具有增强植物的机械强度、调控细胞的生长、抵御病菌危害及逆境影响、参与植物的物质运输和细胞间的信息传递等功能[3]。由于单胃动物消化道缺乏降解植物细胞壁组分的酶系统，对于植物性饲料而言，细胞壁结构是影响细胞内养分消化吸收的重要障碍。
激光共聚焦显微镜（CLSM）是20世纪80年代发展起来的结合激光束的扫描功能和数字技术形成的一种新型光学显微技术，是把激光光学技术与数字图像处理技术相结合产生的一种高分辨率显微镜。与传统光学显微镜相比，它具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图像等优点[4]。本实验通过使用CLSM对小麦麸和大豆皮的饲料原料、回肠和粪便样品进行观察，揭示了小麦麸和大豆皮的细胞壁结构在消化过程中的动态变化规律，为探究细胞壁源性生物活性物质的开发利用和提高植物性饲料资源利用效率提供理论依据。
1 材料与方法
实验材料与试剂
实验材料
本实验所使用的小麦麸和大豆皮原料、由上述原料作为单一纤维来源配制的4种饲粮(分添加/未添加细胞壁降解酶)经生长猪消化后的回肠末端食糜和粪便样品来自于高月琴，王伟兰，张亚伟，陈练，张志静等人的试验[5]。材料分为：(1)小麦麸原料(W)、小麦麸回肠食糜(WL)、小麦麸加酶回肠食糜样(+WL)、小麦麸粪便食糜样(WF)、小麦麸加酶粪便食糜样(+WF)，(2)大豆皮原料(S)、大豆皮回肠食糜样(SL)、大豆皮加酶回肠食糜样(+SL)、大豆皮粪便食糜样(SF)、大豆皮加酶粪便食糜样(+SF)。
实验试剂
用50mM pH 7.0磷酸缓冲溶液配制300 mg/L卡尔科弗卢尔荧光增白剂染色液 (Fluorescent Brightener 28, sigma公司）。
1．2 实验仪器
分析天平（北京赛多利斯，BS224S）；干燥器(南京寿德试剂有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱(海声达，DHG06200B）；恒温振荡水浴锅(Crystal，SY2230）；漩涡混合器(SI，Genie2）；低速冷冻离心机(Beckman，J6M）；激光共聚焦显微镜(上海莱瑟光谱仪器分析技术有限公司，ZEISS LSM 700）
1．3 实验方法
1．3．1 纤维素染色步骤
本试验参照chen等的研究方法[6]。具体的染色步骤如下：分别称取10mg的小麦麸和大豆皮原料、由上述原料作为单一纤维来源配制的4种饲粮(分添加/未添加细胞壁降解酶)经生长猪消化后的回肠末端食糜和粪便样品（已经淀粉酶、胃蛋白酶处理，且脱脂处理）。加入10ml PBS冲洗3次（离心、3500 rpm，5 min），加入20mL 的FB28 PBS溶液（300 mg/L）后放入恒温震荡水浴锅4小时后取出。用10 mL超纯水冲洗3次（离心、3500 rpm，5 min）后沉淀，加入12 mL超纯水稀释，混匀后吸取30 μL悬浊液涂于载玻片上，抹匀后放入烘箱干燥。
1．3．2 激光共聚焦显微镜观察参数设定
使用共聚焦激光显微镜对切片样品进行观察。FB28的激发波长为364nm，发射波长为410480nm[7]。木质素的激发波长488nm，发射波长523nm [8]。利用共聚焦激光显微镜观察样品时，观测物镜为20X和40X，分辨率为1024*1024 pixels，选择激光通道为405nm和488nm。
2 结果与分析
2．1 CSLM的观察结果
纤维素是植物纤维原料的最主要化学成分，纤维素是由βD葡萄糖基通过1,4糖苷键联结而成的线状高分子化合物[9]。卡尔科弗卢尔荧光增白剂能与β(1→4)及β(1→3)葡聚糖结合对纤维素进行标记，利用FB28受364 nm紫外线激发而发出410480nm蓝色荧光的性质,对细胞壁内β葡聚糖进行定位[10]。利用木质素是苯基丙烷结构单元(即C6C3单元)中所含芳香性基团能被488nm波长激光激发发射523nm绿色荧光[8]，对细胞壁中木质素进行定位。
2．1．1 小麦麸的观察结果
小麦麸原料样品经过消化分解，其组织形态，以及细胞壁的组分含量和结构都发生了变化。在小麦麸原料样品（W）中，图1c所示，全光谱显微图中能观察到大片组织块，小麦麸细胞壁呈不规则立方体，纤维网状排列，结构完整，细胞壁间连接紧密。图1a和图1b分别为W中纤维素和木质素的荧光图。图1a所示，W细胞壁上观察到明亮的蓝色荧光，表明纤维素含量较高。在细胞壁的不同区域蓝色荧光的强度不同，表明纤维素含量有差异，总体来看，纤维素主要分布在次生壁(S层)，在复合胞间层(CML)和细胞角隅胞间层(CCML)分布较少。图1b所示，W细胞壁上发出微弱绿色荧光，表明木质素含量较少。在细胞壁的不同区域绿色荧光的强度不同，表明木质素含量有差异，木质素主要分布在CCML和CML，S层分布较少。从融合图1d来看，绿色荧光区域基本与蓝色荧光区域基本重合，部分区域不重叠。张智衡[11]利用荧光显微镜法对针叶材和阔叶材细胞壁的局部化学研究发现,两者纤维素及木质素的分布具有相似性,木质素CCML处浓度最,CML中浓度较低,S2层中浓度最低。纤维素分布情况与木质素正相反,S2层中浓度最高,其次是CML，CCML中浓度最低。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1□材料与方法4
1.1□实验材料与试剂4
1.1.1□实验材料4
1.1.2□实验试剂4
1.2□实验仪器4
1.3□实验方法4
1.3.1□荧光染色步骤4
1.3.2□激光共聚焦显微镜观察参数设定5
2□结果与分析5
2.1□CLSM的观察结果5
2.1.1□小麦麸的观察结果5
2.1.2□大豆皮的观察结果7
3□讨论9
致谢10
参考文献10
利用激光共聚焦显微镜对小麦麸和大豆皮细胞壁及其消化残渣形态的观察
动物科学学生 李俊尊
引言
引言
近年来，饲料原料价格的上涨促使养殖和饲料企业积极寻找价廉物美的替代原料。小麦麸俗称麸皮，是小麦籽实为原料加工面粉后剩余的种皮、糊粉层、部分胚芽与少量胚乳的混合物，营养丰富，常被用作饲料原料。但因小麦麸中粗纤维含量较高（8.5%12.0%），但养分的消化率与有效能值较低[1]。我国 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
年产小麦1.3亿吨左右，按20%出麸率计算，小麦麸年产可达2600万吨，若提高其养分利用效率，可有效解决缓和饲料资源紧缺的局面。大豆皮是大豆脱皮制油加工过程中的副产物，主要是大豆外层包被的物质。虽然中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）的含量很高，但木质素的含量不足 2% ，这使得大豆皮的活体外干物质消化率高达90%[2]。大豆皮已然成为一种可开发利用的非常规饲料原料资源，利用好这一资源不但可以避免粮食供给压力，人畜争粮矛盾亦可缓解。
植物细胞壁是植物细胞区别于动物细胞的主要特征之一，是植物活细胞的重要组成部分，其主要成分包括纤维素、半纤维素、果胶质和木质素等。它主要具有增强植物的机械强度、调控细胞的生长、抵御病菌危害及逆境影响、参与植物的物质运输和细胞间的信息传递等功能[3]。由于单胃动物消化道缺乏降解植物细胞壁组分的酶系统，对于植物性饲料而言，细胞壁结构是影响细胞内养分消化吸收的重要障碍。
激光共聚焦显微镜（CLSM）是20世纪80年代发展起来的结合激光束的扫描功能和数字技术形成的一种新型光学显微技术，是把激光光学技术与数字图像处理技术相结合产生的一种高分辨率显微镜。与传统光学显微镜相比，它具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图像等优点[4]。本实验通过使用CLSM对小麦麸和大豆皮的饲料原料、回肠和粪便样品进行观察，揭示了小麦麸和大豆皮的细胞壁结构在消化过程中的动态变化规律，为探究细胞壁源性生物活性物质的开发利用和提高植物性饲料资源利用效率提供理论依据。
1 材料与方法
实验材料与试剂
实验材料
本实验所使用的小麦麸和大豆皮原料、由上述原料作为单一纤维来源配制的4种饲粮(分添加/未添加细胞壁降解酶)经生长猪消化后的回肠末端食糜和粪便样品来自于高月琴，王伟兰，张亚伟，陈练，张志静等人的试验[5]。材料分为：(1)小麦麸原料(W)、小麦麸回肠食糜(WL)、小麦麸加酶回肠食糜样(+WL)、小麦麸粪便食糜样(WF)、小麦麸加酶粪便食糜样(+WF)，(2)大豆皮原料(S)、大豆皮回肠食糜样(SL)、大豆皮加酶回肠食糜样(+SL)、大豆皮粪便食糜样(SF)、大豆皮加酶粪便食糜样(+SF)。
实验试剂
用50mM pH 7.0磷酸缓冲溶液配制300 mg/L卡尔科弗卢尔荧光增白剂染色液 (Fluorescent Brightener 28, sigma公司）。
1．2 实验仪器
分析天平（北京赛多利斯，BS224S）；干燥器(南京寿德试剂有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱(海声达，DHG06200B）；恒温振荡水浴锅(Crystal，SY2230）；漩涡混合器(SI，Genie2）；低速冷冻离心机(Beckman，J6M）；激光共聚焦显微镜(上海莱瑟光谱仪器分析技术有限公司，ZEISS LSM 700）
1．3 实验方法
1．3．1 纤维素染色步骤
本试验参照chen等的研究方法[6]。具体的染色步骤如下：分别称取10mg的小麦麸和大豆皮原料、由上述原料作为单一纤维来源配制的4种饲粮(分添加/未添加细胞壁降解酶)经生长猪消化后的回肠末端食糜和粪便样品（已经淀粉酶、胃蛋白酶处理，且脱脂处理）。加入10ml PBS冲洗3次（离心、3500 rpm，5 min），加入20mL 的FB28 PBS溶液（300 mg/L）后放入恒温震荡水浴锅4小时后取出。用10 mL超纯水冲洗3次（离心、3500 rpm，5 min）后沉淀，加入12 mL超纯水稀释，混匀后吸取30 μL悬浊液涂于载玻片上，抹匀后放入烘箱干燥。
1．3．2 激光共聚焦显微镜观察参数设定
使用共聚焦激光显微镜对切片样品进行观察。FB28的激发波长为364nm，发射波长为410480nm[7]。木质素的激发波长488nm，发射波长523nm [8]。利用共聚焦激光显微镜观察样品时，观测物镜为20X和40X，分辨率为1024*1024 pixels，选择激光通道为405nm和488nm。
2 结果与分析
2．1 CSLM的观察结果
纤维素是植物纤维原料的最主要化学成分，纤维素是由βD葡萄糖基通过1,4糖苷键联结而成的线状高分子化合物[9]。卡尔科弗卢尔荧光增白剂能与β(1→4)及β(1→3)葡聚糖结合对纤维素进行标记，利用FB28受364 nm紫外线激发而发出410480nm蓝色荧光的性质,对细胞壁内β葡聚糖进行定位[10]。利用木质素是苯基丙烷结构单元(即C6C3单元)中所含芳香性基团能被488nm波长激光激发发射523nm绿色荧光[8]，对细胞壁中木质素进行定位。
2．1．1 小麦麸的观察结果
小麦麸原料样品经过消化分解，其组织形态，以及细胞壁的组分含量和结构都发生了变化。在小麦麸原料样品（W）中，图1c所示，全光谱显微图中能观察到大片组织块，小麦麸细胞壁呈不规则立方体，纤维网状排列，结构完整，细胞壁间连接紧密。图1a和图1b分别为W中纤维素和木质素的荧光图。图1a所示，W细胞壁上观察到明亮的蓝色荧光，表明纤维素含量较高。在细胞壁的不同区域蓝色荧光的强度不同，表明纤维素含量有差异，总体来看，纤维素主要分布在次生壁(S层)，在复合胞间层(CML)和细胞角隅胞间层(CCML)分布较少。图1b所示，W细胞壁上发出微弱绿色荧光，表明木质素含量较少。在细胞壁的不同区域绿色荧光的强度不同，表明木质素含量有差异，木质素主要分布在CCML和CML，S层分布较少。从融合图1d来看，绿色荧光区域基本与蓝色荧光区域基本重合，部分区域不重叠。张智衡[11]利用荧光显微镜法对针叶材和阔叶材细胞壁的局部化学研究发现,两者纤维素及木质素的分布具有相似性,木质素CCML处浓度最,CML中浓度较低,S2层中浓度最低。纤维素分布情况与木质素正相反,S2层中浓度最高,其次是CML，CCML中浓度最低。
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