鸭瘟强毒株的分离及其攻毒模型的建立
鸭瘟又名鸭病毒性肠炎（Duck Viral Enteritis）。目前，江苏各养鸭地区均有流行强毒株感染的报道，本试验从确诊鸭瘟病例中分离地方流行鸭瘟强毒株，并对分离株的致病性性进行了研究。通过研磨和冻融鸭瘟病死肝脏组织，制备了鸭瘟肝脏组织毒JS01。为了检测鸭瘟组织毒JS01的致病力和确定组织毒的最小攻毒剂量, 将制备的组织毒按10-1，10-2，10-3，10-4， 10-5，10-6和10-7递倍稀释，每个稀释度每只1mL，分别肌肉接种金定蛋鸭6只；接种后观察记录蛋鸭的发病与死亡情况。试验结果表明，分离的鸭瘟肝脏组织毒JS01具有很强的致病力，其中10-1，10-2，10-3，10-4，10-5稀释度具有100%的致死性，肝脏组织毒JS01的最小致死量MLD为肝脏组织毒10-7稀释。由此可见，鸭瘟强毒株肝脏组织毒JS01攻毒模型使用剂量为1000 MLD，即肝脏组织毒10-4稀释，每只肌肉注射1mL。本鸭瘟组织毒攻毒模型的建立，为后期研发鸭瘟疫苗的攻毒保护性研究提供了理论依据。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.2 动物试验 2
1.2.1 动物说明 2
1.2.2 饲养场地消毒 2
1.2.3 进入试验和排除出试验的动物标准 2
1.2.4 鉴别 2
1.2.5 饲养与管理 3
1.2.6 试验动物的饲养与清洁卫生 3
1.3 鸭瘟肝脏组织毒的制作 3
1.4 分组与剂量 3
1.4.1 分组 3
1.4.2 剂量 3
1.4.3 对分组的说明 3
1.5 试验方法与研究指标 3
1.5.1 试验方法 3
1.5.2 研究指标 3
2 试验结果 3
2.1 鸭子精神状态 3
2.2 病死鸭子解剖症状 4
2.3 病死记录结果 4
3 讨论 5
致谢 5
参考文 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
献 6
鸭瘟强毒株的分离及其攻毒模型的建立
引言
引言
鸭瘟又名鸭病毒性肠炎（Duck Viral Enteritis），是由鸭肠炎病毒（Duck Enteritis virus, DEV）引起，是鸭、鹅和其他雁形目禽类的急性、热性和败血性传染病。主要以血管损伤、消化道出血性坏死、淋巴器官受损和实质性器官退行性变化为主要特征。在不同品种、年龄和性别的鸭群中均易感，而成年鸭的发病率高于幼鸭，其中以产蛋母鸭的死亡率最高。[1]
该病由Baudet等首次报道于荷兰[2]，黄引贤等于1959年在我国首次发现该病的存在[3]，随后本病广泛流行于我国南部、中部和东部等养鸭较多的省、市。在此期间，我国研究者先后研制出鸭瘟组织灭活疫苗和鸡胚连续传代弱毒疫苗，使其流行情况得到了一定程度的控制[4]。1983年，廖得惠[5]在四川省成功分离出鸭瘟病毒。该病是目前对世界范围内水禽养殖业危害较为严重的疫病之一[6]，该病已被世界动物卫生组织认定为B类传染病，我国动物防疫法也将其列入二类动物疫病[7]。
目前用于预防 DVE 的疫苗有灭活苗和弱毒苗两大类，其中灭活苗主要包括脏器灭活苗、鸡胚灭活苗、鸭胚灭活苗等；弱毒苗主要包括鸡胚化弱毒苗、鸡胚化弱毒细胞苗和自然弱毒苗等。但是灭活疫苗由于制作麻烦、容易污染、成本高、产量少、免疫期短等缺点，很难满足大规模防治的需要，而且一般认为灭活疫苗免疫效力不及弱毒苗[8]。目前，江苏各地养鸭场均有鸭瘟强毒株的爆发，剖检变化同鸭瘟症状相似，可以侵害各个日龄的鸭子，成年鸭发病明显，常用的鸭瘟疫苗不能预防该病的发生。据报道，同2006年在广东广州、佛山等地发生一种以肿头、脚软、流泪、拉绿色稀粪及消化道泄殖腔溃疡、肝脏出血和坏死为主要特征的鸭瘟病毒较为相似[9]。本实验室前期工作，从江苏规模化发病鸭场采集了病料，通过对鸭瘟病毒的分离和鉴定、确定为鸭瘟流行强毒株。本试验首先制备了鸭瘟强毒株肝脏组织毒JS01，并通过将肝脏组织毒JS01以不同浓度接种鸭只，观察和记录其发病和死亡情况，来建立本毒株鸭瘟组织毒攻毒模型，摸索本鸭瘟组织毒的最小致死量，为后期研发鸭瘟疫苗的攻毒保护性研究提供了理论依据。
材料与方法
1.1 材料
试剂：PBS缓冲液（称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.42g，磷酸二氢钾0.27g 于烧杯中，向烧杯中加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将pH值调整至7.4，然后加蒸馏水定容至1L，高温高压灭菌后使用。）
试验动物：金定蛋鸭，购自沭阳县中心鹅鸭场。
1.2 动物试验
1.2.1 动物说明
购入鸭只为50只1日龄雏鸭，由专人负责饲喂，至第6周母源抗体完全消失时进行动物接种。
1.2.2 饲养场地消毒
在开放环境中饲养，进雏之前进行全面彻底的清扫，先用清水清洗一遍笼舍，再用福尔马林15ml/m3加7.5g高锰酸钾进行熏蒸消毒，密闭24小时后，打开门窗通风，让实验房换入新鲜空气。
1.2.3 进入试验和排除出试验的动物标准
在接种前3天，核实鸭只的全身身体情况和临床疾病情况。凡不健康的动物排除出试验，所有进行试验的动物均应健康。
1.2.4 鉴别
根据笼号和脚环颜色进行标记。
1.2.5 饲养与管理
1.2.5.1 饲料：均采用全价配合饲料，购自南京金象特种饲料有限公司。
1.2.5.2饮水：采用自来水。自由饮水和采食。
1.2.5.3温度：进雏前预热12h以上，饲养初期温度需30℃以上，以后每3d降1℃。
1.2.5.4光照：采用60W白炽灯，灯高2m，第1周光照时间为2024h，光照强度为4W/m2。第2周自然光照加宵灯，光照强度为3W/m2。第34周自然光照加宵灯，光照强度为2W/m2。
1.2.4.5通风换气：根据天气情况，适时通风换气，但避免风直吹鸭体。
1.2.6 试验动物的饲养与清洁卫生
由专人饲养，每天进行两次清洁卫生。
1.3 鸭瘟肝脏组织毒的制作
无菌采取鸭瘟病死肝脏，做剪碎研磨处理，按照重量比 肝脏：PBS=1:5加稀释液重悬；在70℃和25℃反复冻融三次后，12000 r/min 离心10min，取上清；然后用0.22um的过滤器过滤上清，收集过滤液于试剂瓶内，分装1.5uL EP管内保存于70℃冰箱备用。
1.4 分组与剂量
1.4.1 分组
将鸭只随机分组，空白，101，102，103，104， 105，106和107共8组。
表2 试验鸭只分组情况表
组别
接种量
接种途径
动物数
动物标记（笼号、脚环颜色和编号）
空白对照
1mL PBS
肌肉
6
无
101
1mL
肌肉
6
红色
102
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.2 动物试验 2
1.2.1 动物说明 2
1.2.2 饲养场地消毒 2
1.2.3 进入试验和排除出试验的动物标准 2
1.2.4 鉴别 2
1.2.5 饲养与管理 3
1.2.6 试验动物的饲养与清洁卫生 3
1.3 鸭瘟肝脏组织毒的制作 3
1.4 分组与剂量 3
1.4.1 分组 3
1.4.2 剂量 3
1.4.3 对分组的说明 3
1.5 试验方法与研究指标 3
1.5.1 试验方法 3
1.5.2 研究指标 3
2 试验结果 3
2.1 鸭子精神状态 3
2.2 病死鸭子解剖症状 4
2.3 病死记录结果 4
3 讨论 5
致谢 5
参考文 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
献 6
鸭瘟强毒株的分离及其攻毒模型的建立
引言
引言
鸭瘟又名鸭病毒性肠炎（Duck Viral Enteritis），是由鸭肠炎病毒（Duck Enteritis virus, DEV）引起，是鸭、鹅和其他雁形目禽类的急性、热性和败血性传染病。主要以血管损伤、消化道出血性坏死、淋巴器官受损和实质性器官退行性变化为主要特征。在不同品种、年龄和性别的鸭群中均易感，而成年鸭的发病率高于幼鸭，其中以产蛋母鸭的死亡率最高。[1]
该病由Baudet等首次报道于荷兰[2]，黄引贤等于1959年在我国首次发现该病的存在[3]，随后本病广泛流行于我国南部、中部和东部等养鸭较多的省、市。在此期间，我国研究者先后研制出鸭瘟组织灭活疫苗和鸡胚连续传代弱毒疫苗，使其流行情况得到了一定程度的控制[4]。1983年，廖得惠[5]在四川省成功分离出鸭瘟病毒。该病是目前对世界范围内水禽养殖业危害较为严重的疫病之一[6]，该病已被世界动物卫生组织认定为B类传染病，我国动物防疫法也将其列入二类动物疫病[7]。
目前用于预防 DVE 的疫苗有灭活苗和弱毒苗两大类，其中灭活苗主要包括脏器灭活苗、鸡胚灭活苗、鸭胚灭活苗等；弱毒苗主要包括鸡胚化弱毒苗、鸡胚化弱毒细胞苗和自然弱毒苗等。但是灭活疫苗由于制作麻烦、容易污染、成本高、产量少、免疫期短等缺点，很难满足大规模防治的需要，而且一般认为灭活疫苗免疫效力不及弱毒苗[8]。目前，江苏各地养鸭场均有鸭瘟强毒株的爆发，剖检变化同鸭瘟症状相似，可以侵害各个日龄的鸭子，成年鸭发病明显，常用的鸭瘟疫苗不能预防该病的发生。据报道，同2006年在广东广州、佛山等地发生一种以肿头、脚软、流泪、拉绿色稀粪及消化道泄殖腔溃疡、肝脏出血和坏死为主要特征的鸭瘟病毒较为相似[9]。本实验室前期工作，从江苏规模化发病鸭场采集了病料，通过对鸭瘟病毒的分离和鉴定、确定为鸭瘟流行强毒株。本试验首先制备了鸭瘟强毒株肝脏组织毒JS01，并通过将肝脏组织毒JS01以不同浓度接种鸭只，观察和记录其发病和死亡情况，来建立本毒株鸭瘟组织毒攻毒模型，摸索本鸭瘟组织毒的最小致死量，为后期研发鸭瘟疫苗的攻毒保护性研究提供了理论依据。
材料与方法
1.1 材料
试剂：PBS缓冲液（称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.42g，磷酸二氢钾0.27g 于烧杯中，向烧杯中加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将pH值调整至7.4，然后加蒸馏水定容至1L，高温高压灭菌后使用。）
试验动物：金定蛋鸭，购自沭阳县中心鹅鸭场。
1.2 动物试验
1.2.1 动物说明
购入鸭只为50只1日龄雏鸭，由专人负责饲喂，至第6周母源抗体完全消失时进行动物接种。
1.2.2 饲养场地消毒
在开放环境中饲养，进雏之前进行全面彻底的清扫，先用清水清洗一遍笼舍，再用福尔马林15ml/m3加7.5g高锰酸钾进行熏蒸消毒，密闭24小时后，打开门窗通风，让实验房换入新鲜空气。
1.2.3 进入试验和排除出试验的动物标准
在接种前3天，核实鸭只的全身身体情况和临床疾病情况。凡不健康的动物排除出试验，所有进行试验的动物均应健康。
1.2.4 鉴别
根据笼号和脚环颜色进行标记。
1.2.5 饲养与管理
1.2.5.1 饲料：均采用全价配合饲料，购自南京金象特种饲料有限公司。
1.2.5.2饮水：采用自来水。自由饮水和采食。
1.2.5.3温度：进雏前预热12h以上，饲养初期温度需30℃以上，以后每3d降1℃。
1.2.5.4光照：采用60W白炽灯，灯高2m，第1周光照时间为2024h，光照强度为4W/m2。第2周自然光照加宵灯，光照强度为3W/m2。第34周自然光照加宵灯，光照强度为2W/m2。
1.2.4.5通风换气：根据天气情况，适时通风换气，但避免风直吹鸭体。
1.2.6 试验动物的饲养与清洁卫生
由专人饲养，每天进行两次清洁卫生。
1.3 鸭瘟肝脏组织毒的制作
无菌采取鸭瘟病死肝脏，做剪碎研磨处理，按照重量比 肝脏：PBS=1:5加稀释液重悬；在70℃和25℃反复冻融三次后，12000 r/min 离心10min，取上清；然后用0.22um的过滤器过滤上清，收集过滤液于试剂瓶内，分装1.5uL EP管内保存于70℃冰箱备用。
1.4 分组与剂量
1.4.1 分组
将鸭只随机分组，空白，101，102，103，104， 105，106和107共8组。
表2 试验鸭只分组情况表
组别
接种量
接种途径
动物数
动物标记（笼号、脚环颜色和编号）
空白对照
1mL PBS
肌肉
6
无
101
1mL
肌肉
6
红色
102
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