猪丹毒不同形式菌苗的免疫特性研究
猪丹毒不同形式菌苗的免疫特性研究[20200507191847]
摘要：猪丹毒(swine erysipelas)，是由猪丹毒杆菌引起的一种急性、热性传染病，给畜牧业带来了巨大的危害，疫苗免疫是当前防控该病最有效的手段。本研究通过比较1%甲醛灭活苗、0.4%吖啶橙灭活苗、高压菌体浸出物、沉淀细菌后上清、弱毒苗5种方法免疫效果，以期寻找一种最高效、安全的疫苗。小鼠皮下注射灭活苗菌数1.5×109CFU/只，弱毒苗菌数1×107CFU/只，每只注射0.1mL。一免后14天进行二次免疫，第28天强毒株按菌数1×104CFU/只进行攻毒，每只注射0.1mL，对照小鼠皮下都相应注射PBS。分别在一免后7天、14天、28天、42天小鼠尾尖采血，间接ELISA方法测抗体水平。结果表明，上清组、AO组、高压浸出物组、甲醛组虽然抗体随时间略有上升，但其抗体水平差异不显著，而弱毒苗从一免后第7天抗体水平就有明显升高，在一免后第14天与第28天抗体始终保持在较高水平。灭活苗对小鼠不能提供完全的保护，相比之下，弱毒苗所用剂量小，而且能完全保护小鼠受丹毒强毒株的致死性感染。
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关键字:猪丹毒；免疫特性；ELISA；灭活方法；弱毒苗
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1菌种、试剂及实验动物 2
1.2丹毒杆菌纯度检验 3
1.3灭活疫苗及弱毒疫苗制备 3
1.3.1甲醛灭活组3
1.3.2吖啶橙灭活组3
1.3.3沉淀取上清组3
1.3.4高压浸出物组3
1.3.5弱毒组3
1.3小鼠免疫及攻毒试验4
1.4间接ELISA测小鼠血清抗体4
2结果与分析4
2.1猪丹毒杆菌纯度检验4
2.1免疫保护试验5
2.2各组小鼠抗体水平的ELISA检测6
3讨论6
4致谢7
5参考文献7
猪丹毒不同形式菌苗的免疫特性研究
引言
猪丹毒(swine erysipelas)，是由猪丹毒杆菌引起的一种人畜共患的急性、热性传染病 [1], 猪丹毒杆菌，革兰氏染色阳性，为一种平直或微弯纤细小杆菌，大小为0.8-0.2μm×0.2-0.5μm[2]。猪感染后主要特征表现为高热、急性败血症、皮肤疹块、慢性疣状心内膜炎及多发性非化脓性关节炎[3]，给人类健康和畜牧业带来极大的危害。上世纪八十年代以前，猪丹毒曾在我国各地养猪地区普遍流行，后来随着对猪病防治水平的提高一度得到有效的控制[4]，然而近几年，由于许多猪场对猪丹毒的忽视，许多猪场甚至没有做猪丹毒的预防措施，导致猪丹毒卷土重来，给猪场造成了巨大的经济损失[5]。其广泛流行不仅在我国出现，从2009年开始，日本猪丹毒发病率也是逐年上升[6]，丹毒的流行呈世界 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
范围扩大趋势。
目前，我国使用的猪丹毒疫苗主要是猪丹毒灭活疫苗和猪丹毒弱毒疫苗[7]。灭活疫苗多为甲醛灭活疫苗，它能使微生物的蛋白质、核酸变性从而导致细菌死亡却不明显影响其免疫原性，灭活疫苗不会受母源抗体的干扰，不会引起毒力返强，相对比较安全。但是相对于弱毒疫苗，灭活疫苗接种剂量相对要求比较大，且弱毒疫苗产生效果快，所需剂量小[8]。
由于甲醛灭活有可能破坏部分抗原从而影响免疫效果，本实验使用吖啶橙作为灭活剂，吖啶橙作为一种核酸染料鉴别病原菌[9]，它可与细胞中DNA、RNA结合，从而杀死细菌却不影响其免疫原性，目前关于吖啶橙作为灭活剂灭活细菌还没有相关报道。另外有研究发现，猪丹毒的保护性抗原也会存在于它的培养液上清中[10]。实验室常用高压消毒，却没有相关资料显示高压灭活细菌后其免疫原性及作为一种灭活方法是否有免疫效果。
本实验通过甲醛、吖啶橙、高压浸出物、沉淀细菌取上清四种灭活方法灭活丹毒杆菌，并与弱毒疫苗效果进行研究比较，旨在寻找一种最安全、效果最好的疫苗，以减少丹毒对我国畜牧养殖业带来的经济损失。
1.材料和方法
1.1菌种、试剂及实验动物
丹毒强毒株为实验室在临床上分离得到由实验室保存；弱毒丹毒为实验室临床分离到的强毒株在AO平板上连续传了50代致弱毒株。
固体BHI培养基是由52g牛脑心浸出液琼脂加至1000mL去离子水，并加入0.1%吐温80后，121℃高压灭菌得到。液体BHI培养基是将38.5g牛脑心浸出液加至1000mL去离子水后121℃高压灭菌得到，使用前需加入牛血清。弗氏佐剂订购自SIGMA公司。甲醛溶液来自广东西陇化工股份有限公司，吖啶橙购自上海Aladdin公司。羊抗鼠IgG-HRP购自南京生兴生物公司。
生物分光光度计由美国BIO-RAD公司生产。PCR仪由Amp Gene公司生产。
6周龄SPF级ICR雌性小鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
1.2丹毒杆菌纯度检验
将丹毒强毒、弱毒株分别接种至BHI培养基培养后，取少量菌液滴在载玻片上进行革兰氏染色。革兰氏染色步骤如下：
(1)常规制作标本，干燥固定；
(2)草酸铵结晶紫染色30s，水洗；
(3)加革兰氏碘液作用1min，水洗；
(4)滴加95%酒精脱色30s，水洗；
(5)沙黄复染1min，水洗，干燥，滴加香柏油镜检。
将丹毒菌液进行菌液PCR鉴定，PCR体系25μL。根据 Shinya Nagai等人的文献[11]，丹毒的上游引物： 5′-GTGAAACACCGTATTTTAGT A-3′，下游引物：5′- TTCAAGAAGTTCCTGTAGTTT-3′。分别为模板2μL，上、下游引物各1μL，2×Taq Master Mix 12.5μL，ddH2O 8.5μL。反应程序如下：预变性94℃ 5min、变性94℃ 45s、退火55℃ 1min、延伸72℃ 30s、终延伸72℃ 5min，共35个循环。
1.3灭活疫苗及弱毒疫苗制备
1.3.1甲醛灭活组
将丹毒强毒株按1:100加入BHI液体培养基中（按1:20加相应体积血清），37℃摇床200rpm，根据猪丹毒杆菌生长曲 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
线7h后进入对数期，测OD600nm值，然后4000rpm离心10min，弃去部分上清，将丹毒菌液浓缩至1.5×1010CFU/mL(为保证每只小鼠注射剂量相同，事先已建立了菌落生成单位（CFU）与OD值之间的关系，OD值为0.475其浓度为4×109CFU/mL)，加入1%甲醛灭活24h，然后接种在BHI平板上，24h后观察有无菌落生成，若灭活完全则用弗氏佐剂按体积比1:1乳化。
1.3.2吖啶橙灭活组
将丹毒强毒株按1:100加入BHI液体培养基中（按1:20加相应体积血清），37℃摇床200rpm，根据猪丹毒杆菌生长曲线，7h后进入对数期，测OD600nm值，然后4000rpm离心10min，弃去部分上清，将丹毒菌液浓缩至1.5×1010CFU/mL(为保证每只小鼠注射剂量相同，事先已建立了菌落生成单位（CFU）与OD值之间的关系，OD值为0.475其细菌数为4×109CFU/mL)，加入0.4%吖啶橙灭活，24h后接种在BHI平板上，24h后观察有无菌落生成，若灭活完全则7500g离心20min，弃去上清加入PBS重悬，然后用弗氏佐剂按体积比1:1乳化。
1.3.3沉淀取上清组
将丹毒强毒株按1:100加入BHI液体培养基中（按1:20加相应体积血清），37℃摇床200rpm，根据猪丹毒杆菌生长曲线，7h后进入对数期，测OD600nm值，然后4000rpm离心10min，弃去部分上清，将丹毒菌液浓缩至1.5×1010CFU/mL(为保证每只小鼠注射剂量相同，事先已建立了菌落生成单位（CFU）与OD值之间的关系，OD值为0.475其细菌数为4×109CFU/mL)，7500g离心20min[12]后取上清，用0.22μm滤器过滤后，用3kDa超滤管8000rpm，15min浓缩[10,13]，加PBS重悬，取少量上清液接种在BHI平板上，24h后观察有无菌落生成，若滤过完全则用弗氏佐剂按体积比1:1乳化。
此外，我也非常感谢实验室的师兄师姐们，尤其是邹垚师兄，在我实验遇到困难的时候，他们总能热心地和我交流讨论，帮我分析问题原因，找出解决方法，和他们在一起学习工作，我获益良多。
摘要：猪丹毒(swine erysipelas)，是由猪丹毒杆菌引起的一种急性、热性传染病，给畜牧业带来了巨大的危害，疫苗免疫是当前防控该病最有效的手段。本研究通过比较1%甲醛灭活苗、0.4%吖啶橙灭活苗、高压菌体浸出物、沉淀细菌后上清、弱毒苗5种方法免疫效果，以期寻找一种最高效、安全的疫苗。小鼠皮下注射灭活苗菌数1.5×109CFU/只，弱毒苗菌数1×107CFU/只，每只注射0.1mL。一免后14天进行二次免疫，第28天强毒株按菌数1×104CFU/只进行攻毒，每只注射0.1mL，对照小鼠皮下都相应注射PBS。分别在一免后7天、14天、28天、42天小鼠尾尖采血，间接ELISA方法测抗体水平。结果表明，上清组、AO组、高压浸出物组、甲醛组虽然抗体随时间略有上升，但其抗体水平差异不显著，而弱毒苗从一免后第7天抗体水平就有明显升高，在一免后第14天与第28天抗体始终保持在较高水平。灭活苗对小鼠不能提供完全的保护，相比之下，弱毒苗所用剂量小，而且能完全保护小鼠受丹毒强毒株的致死性感染。
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关键字:猪丹毒；免疫特性；ELISA；灭活方法；弱毒苗
目录
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Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1菌种、试剂及实验动物 2
1.2丹毒杆菌纯度检验 3
1.3灭活疫苗及弱毒疫苗制备 3
1.3.1甲醛灭活组3
1.3.2吖啶橙灭活组3
1.3.3沉淀取上清组3
1.3.4高压浸出物组3
1.3.5弱毒组3
1.3小鼠免疫及攻毒试验4
1.4间接ELISA测小鼠血清抗体4
2结果与分析4
2.1猪丹毒杆菌纯度检验4
2.1免疫保护试验5
2.2各组小鼠抗体水平的ELISA检测6
3讨论6
4致谢7
5参考文献7
猪丹毒不同形式菌苗的免疫特性研究
引言
猪丹毒(swine erysipelas)，是由猪丹毒杆菌引起的一种人畜共患的急性、热性传染病 [1], 猪丹毒杆菌，革兰氏染色阳性，为一种平直或微弯纤细小杆菌，大小为0.8-0.2μm×0.2-0.5μm[2]。猪感染后主要特征表现为高热、急性败血症、皮肤疹块、慢性疣状心内膜炎及多发性非化脓性关节炎[3]，给人类健康和畜牧业带来极大的危害。上世纪八十年代以前，猪丹毒曾在我国各地养猪地区普遍流行，后来随着对猪病防治水平的提高一度得到有效的控制[4]，然而近几年，由于许多猪场对猪丹毒的忽视，许多猪场甚至没有做猪丹毒的预防措施，导致猪丹毒卷土重来，给猪场造成了巨大的经济损失[5]。其广泛流行不仅在我国出现，从2009年开始，日本猪丹毒发病率也是逐年上升[6]，丹毒的流行呈世界 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
范围扩大趋势。
目前，我国使用的猪丹毒疫苗主要是猪丹毒灭活疫苗和猪丹毒弱毒疫苗[7]。灭活疫苗多为甲醛灭活疫苗，它能使微生物的蛋白质、核酸变性从而导致细菌死亡却不明显影响其免疫原性，灭活疫苗不会受母源抗体的干扰，不会引起毒力返强，相对比较安全。但是相对于弱毒疫苗，灭活疫苗接种剂量相对要求比较大，且弱毒疫苗产生效果快，所需剂量小[8]。
由于甲醛灭活有可能破坏部分抗原从而影响免疫效果，本实验使用吖啶橙作为灭活剂，吖啶橙作为一种核酸染料鉴别病原菌[9]，它可与细胞中DNA、RNA结合，从而杀死细菌却不影响其免疫原性，目前关于吖啶橙作为灭活剂灭活细菌还没有相关报道。另外有研究发现，猪丹毒的保护性抗原也会存在于它的培养液上清中[10]。实验室常用高压消毒，却没有相关资料显示高压灭活细菌后其免疫原性及作为一种灭活方法是否有免疫效果。
本实验通过甲醛、吖啶橙、高压浸出物、沉淀细菌取上清四种灭活方法灭活丹毒杆菌，并与弱毒疫苗效果进行研究比较，旨在寻找一种最安全、效果最好的疫苗，以减少丹毒对我国畜牧养殖业带来的经济损失。
1.材料和方法
1.1菌种、试剂及实验动物
丹毒强毒株为实验室在临床上分离得到由实验室保存；弱毒丹毒为实验室临床分离到的强毒株在AO平板上连续传了50代致弱毒株。
固体BHI培养基是由52g牛脑心浸出液琼脂加至1000mL去离子水，并加入0.1%吐温80后，121℃高压灭菌得到。液体BHI培养基是将38.5g牛脑心浸出液加至1000mL去离子水后121℃高压灭菌得到，使用前需加入牛血清。弗氏佐剂订购自SIGMA公司。甲醛溶液来自广东西陇化工股份有限公司，吖啶橙购自上海Aladdin公司。羊抗鼠IgG-HRP购自南京生兴生物公司。
生物分光光度计由美国BIO-RAD公司生产。PCR仪由Amp Gene公司生产。
6周龄SPF级ICR雌性小鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
1.2丹毒杆菌纯度检验
将丹毒强毒、弱毒株分别接种至BHI培养基培养后，取少量菌液滴在载玻片上进行革兰氏染色。革兰氏染色步骤如下：
(1)常规制作标本，干燥固定；
(2)草酸铵结晶紫染色30s，水洗；
(3)加革兰氏碘液作用1min，水洗；
(4)滴加95%酒精脱色30s，水洗；
(5)沙黄复染1min，水洗，干燥，滴加香柏油镜检。
将丹毒菌液进行菌液PCR鉴定，PCR体系25μL。根据 Shinya Nagai等人的文献[11]，丹毒的上游引物： 5′-GTGAAACACCGTATTTTAGT A-3′，下游引物：5′- TTCAAGAAGTTCCTGTAGTTT-3′。分别为模板2μL，上、下游引物各1μL，2×Taq Master Mix 12.5μL，ddH2O 8.5μL。反应程序如下：预变性94℃ 5min、变性94℃ 45s、退火55℃ 1min、延伸72℃ 30s、终延伸72℃ 5min，共35个循环。
1.3灭活疫苗及弱毒疫苗制备
1.3.1甲醛灭活组
将丹毒强毒株按1:100加入BHI液体培养基中（按1:20加相应体积血清），37℃摇床200rpm，根据猪丹毒杆菌生长曲 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
线7h后进入对数期，测OD600nm值，然后4000rpm离心10min，弃去部分上清，将丹毒菌液浓缩至1.5×1010CFU/mL(为保证每只小鼠注射剂量相同，事先已建立了菌落生成单位（CFU）与OD值之间的关系，OD值为0.475其浓度为4×109CFU/mL)，加入1%甲醛灭活24h，然后接种在BHI平板上，24h后观察有无菌落生成，若灭活完全则用弗氏佐剂按体积比1:1乳化。
1.3.2吖啶橙灭活组
将丹毒强毒株按1:100加入BHI液体培养基中（按1:20加相应体积血清），37℃摇床200rpm，根据猪丹毒杆菌生长曲线，7h后进入对数期，测OD600nm值，然后4000rpm离心10min，弃去部分上清，将丹毒菌液浓缩至1.5×1010CFU/mL(为保证每只小鼠注射剂量相同，事先已建立了菌落生成单位（CFU）与OD值之间的关系，OD值为0.475其细菌数为4×109CFU/mL)，加入0.4%吖啶橙灭活，24h后接种在BHI平板上，24h后观察有无菌落生成，若灭活完全则7500g离心20min，弃去上清加入PBS重悬，然后用弗氏佐剂按体积比1:1乳化。
1.3.3沉淀取上清组
将丹毒强毒株按1:100加入BHI液体培养基中（按1:20加相应体积血清），37℃摇床200rpm，根据猪丹毒杆菌生长曲线，7h后进入对数期，测OD600nm值，然后4000rpm离心10min，弃去部分上清，将丹毒菌液浓缩至1.5×1010CFU/mL(为保证每只小鼠注射剂量相同，事先已建立了菌落生成单位（CFU）与OD值之间的关系，OD值为0.475其细菌数为4×109CFU/mL)，7500g离心20min[12]后取上清，用0.22μm滤器过滤后，用3kDa超滤管8000rpm，15min浓缩[10,13]，加PBS重悬，取少量上清液接种在BHI平板上，24h后观察有无菌落生成，若滤过完全则用弗氏佐剂按体积比1:1乳化。
此外，我也非常感谢实验室的师兄师姐们，尤其是邹垚师兄，在我实验遇到困难的时候，他们总能热心地和我交流讨论，帮我分析问题原因，找出解决方法，和他们在一起学习工作，我获益良多。
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