早期灌注丁酸钠对新生仔猪肠道总菌数量和炎症因子表达的影响
本试验旨在探究新生仔猪早期灌喂丁酸钠对肠道菌群和炎症因子表达的影响。试验选取10窝（10-11头）新生仔猪，随机分成2组，每组5窝（重复）。试验组新生仔猪每天灌喂20 mL浓度为150 mmol/L的丁酸钠，连续灌喂7天，对照组灌喂相同量的生理盐水。试验的第8和21天，每组随机屠宰1头仔猪。采集胃、回肠和结肠食糜样用于总菌数量的测定，采集回肠组织样用于炎症因子基因表达的检测。结果表明:与对照组相比，灌喂丁酸钠对8日龄和21日龄仔猪胃、回肠和结肠总菌数量无显著影响。与对照组相比，丁酸钠灌注显著降低了8日龄仔猪炎症因子IL-6，IL-8，IFN-γ，IL-10，TGF-β和组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）基因的相对表达量(P < 0.05)；显著降低了21日龄炎症因子IL-8，IFN-γ和IL-1β基因的相对表达量（P < 0.05）。结果提示，早期灌喂丁酸钠可影响新生仔猪的肠黏膜免疫，但对新生仔猪肠道菌群数量没有显著影响。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 试验动物和试验设计 2
1.2 样品的采集与处理 2
1.3 指标测定 2
1.3.1. Realtime PCR检测总菌数量 2
1.3.1.1 食糜样DNA的提取 2
1.3.1.2 DNA纯度和浓度检测 2
1.3.1.3 Realtime PCR定量分析 2
1.3.2 实时荧光定量PCR相对定量炎症因子表达 3
1.3.2.1 回肠组织样RNA提取 3
1.3.2.2 RNA纯度和浓度检测 3
1.3.2.3 RNA反转录合成cDNA 3
1.3.2.4 Realtime PCR定量分析 4
1.4 数据处理与统计分析 4
2 结果与分析 4
2.1 丁酸钠对胃、回肠和结肠内菌群数量的影响 4
2.2 丁酸钠对肠黏膜免疫的影响 4
3 讨论 5
3.1 灌喂丁酸钠对新生仔猪肠道菌群数量的影 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
响 5
3.2 灌喂丁酸钠对仔猪肠黏膜免疫的影响 5
4. 结论 6
致谢 6
参考文献 6
表1 本试验中所用到的引物 3
表2 丁酸钠对仔猪胃，回肠及结肠细菌总量的影响 4
表3 丁酸钠对仔猪回肠炎症因子基因表达的影响 4 早期灌注丁酸钠对新生仔猪肠道总菌数量和炎症因子表达的影响
引言
仔猪的成活率一直对养猪业的发展有着重要影响。新生仔猪一周内主要依靠母源抗体帮助胃肠道抵御外来病原菌，但随着母猪分娩后初乳中抗体成分的下降，作为动物早期防御肠道有害菌的第一道重要屏障，肠黏膜免疫对于保障仔猪健康显得尤为重要。仔猪肠道黏膜免疫的尽早建立，对于机体抵御肠道病原菌和维持健康具有重要的意义。有研究证明与无菌动物相比，正常饲养的动物肠道黏膜免疫系统更趋于完善[1]。早期菌群干预可以降低炎症，过敏性疾病的发生，对仔猪肠道发育及免疫系统具有重要的作用。
丁酸是由畜禽肠道微生物发酵而产生的一种短链脂肪酸。丁酸钠是正丁酸的钠盐，易溶于水，其水溶液pH为碱性，在动物体内可解离为丁酸根和钠离子[2]。大量研究表明，丁酸盐作为一种非常有效的饲料添加剂，在动物出生不久后适量添加，能够提高动物的生产性能，促进胃肠道的消化吸收[3]，保护肠道上皮细胞完整性，提高断奶仔猪肠黏膜屏障功能，改善肠道菌群结构，减少仔猪腹泻，降低经济损失。丁酸不仅作为肠道上皮的能源物质，促进肠细胞的增殖，丁酸及丁酸盐在炎症和肠道菌群方面也起着至关重要的作用[46]。Galfi[6]等人研究表明丁酸钠显著增加了生长猪的体增重，提高了饲料利用率，并且改变了肠道微生物的组成。Collier等[7]的报道也说明，在早期断奶仔猪的日粮中添加0.3%丁酸钠对肠道微生物区系产生的影响最大，显著增加乳酸杆菌在肠道中的比例。
目前已有关于丁酸钠在猪方面的研究主要集中在断奶和保育阶段，而对于新生仔猪的研究却鲜有报道。因此，本研究通过对新生仔猪口服灌注丁酸钠，旨在探究早期丁酸钠干预对新生仔猪肠道菌群及免疫系统的影响。
1 材料与方法
1.1 试验动物和试验设计
选取10窝三元杂交新生仔猪（杜×长×大），每窝1011头仔猪，随机分为两组，即对照组（CO组）和丁酸钠组（SB组），每组5个重复（窝）。在仔猪17日龄，丁酸钠组每头仔猪每天灌喂150 mmol/L丁酸钠20 mL（9：00和15：00各一次，每次10 mL）。对照组灌喂相同剂量的生理盐水，仔猪按照猪场常规管理饲养。
1.2 样品的采集与处理
于仔猪8日龄和21日龄，各重复随机抽取试验仔猪1头进行屠宰，取胃、回肠、结肠食糜样，储存于20℃中，用于提取DNA，采用实时荧光定量PCR技术进行绝对定量检测其总菌数量。采集回肠组织样，提取RNA，采用荧光定量PCR技术对炎症因子进行基因相对定量分析。
1.3 指标测定
1.3.1 Realtime PCR检测总菌数量
1.3.1.1 食糜样DNA的提取
称取约0.1 g解冻后的肠道内容物样至灭菌后的Eppendorf管中，加入1.5 mL的磷酸缓冲液溶液（pH=7.0），涡旋混合，13000 r/min离心5 min，除去上清，参照Dai等[8]的方法，先用珠磨法机械破碎样品，后用酚和氯仿/异戊醇提取其总DNA。
1.3.1.2 DNA纯度和浓度检测
取DNA 2 μL用Thermo Scientific NANODROP 1000分光光度计检测所提取的总DNA浓度和纯度。
1.3.1.3 Realtime PCR定量分析
使用ABI 7500 Realtime PCR仪（Applied Biosysterm）对肠道内容物样中总菌（Total bacteria）进行定量。以化脓拟杆菌（Bacteroides pyogenus）和厚壁菌的16S rRNA基因作为模板制作相应细菌定量的标注曲线。Realtime PCR反应体系为20 μL： 10 μL SYBR Green Supermix（TOYOBO），10 μmol/L的上下游引物各0.4 μL，2 μL样品DNA以及6.8 μL 无菌水。总菌引物序列为F：5`GTGSTGCAYGGYYGTCGTCA3；R：5`ACGTCRTCCMCNCCTTCCTC3。PCR反应程序为：95℃ 10 min，而后95℃ 30 s，60℃下退火及延伸1 min，40个循环。
1.3.2 实时荧光定量PCR相对定量炎症因子表达
1.3.2.1 回肠组织样RNA提取
（1）组织匀浆：从液氮中取出适量的空肠粘膜组织，放入1.5 mL的EP管中，机械匀浆1 min左右，之后室温放置5 min，使其充分裂解。在4℃下，12000 rpm/min离心10 min，取上清液于新的EP管中。（2）氯仿抽提：按照1 mL Trizol reagent加入200 μL氯仿的比例加入氯仿（氯仿：Trizol=1：5），剧烈震荡30 s，使其充分混匀，冰浴10 min，4℃下，12000 rpm/min离心10 min。（3）异丙醇沉淀RNA：小心吸取上层液到一个新的EP管中，加入等体积的预冷的异丙醇，漩涡混匀，冰浴10 min，4 ℃下，12000 rpm/min离心10 min。EP管下层可见RNA沉淀。（4）RNA沉淀洗涤：弃上清，按照1 mL Trizol加入1 mL 75%预冷的乙醇，轻微摇晃洗涤，随后4℃下，8000 rpm/min离心5 min，重复洗涤3次。（5）RNA重溶：弃去乙醇，用离心机甩液滴并用移液器小心吸弃残液，随后在室温条件下在超净台中风干至半透明，然后加入50 μL Rnasefree水，使RNA充分溶解，分装备用。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 试验动物和试验设计 2
1.2 样品的采集与处理 2
1.3 指标测定 2
1.3.1. Realtime PCR检测总菌数量 2
1.3.1.1 食糜样DNA的提取 2
1.3.1.2 DNA纯度和浓度检测 2
1.3.1.3 Realtime PCR定量分析 2
1.3.2 实时荧光定量PCR相对定量炎症因子表达 3
1.3.2.1 回肠组织样RNA提取 3
1.3.2.2 RNA纯度和浓度检测 3
1.3.2.3 RNA反转录合成cDNA 3
1.3.2.4 Realtime PCR定量分析 4
1.4 数据处理与统计分析 4
2 结果与分析 4
2.1 丁酸钠对胃、回肠和结肠内菌群数量的影响 4
2.2 丁酸钠对肠黏膜免疫的影响 4
3 讨论 5
3.1 灌喂丁酸钠对新生仔猪肠道菌群数量的影 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
响 5
3.2 灌喂丁酸钠对仔猪肠黏膜免疫的影响 5
4. 结论 6
致谢 6
参考文献 6
表1 本试验中所用到的引物 3
表2 丁酸钠对仔猪胃，回肠及结肠细菌总量的影响 4
表3 丁酸钠对仔猪回肠炎症因子基因表达的影响 4 早期灌注丁酸钠对新生仔猪肠道总菌数量和炎症因子表达的影响
引言
仔猪的成活率一直对养猪业的发展有着重要影响。新生仔猪一周内主要依靠母源抗体帮助胃肠道抵御外来病原菌，但随着母猪分娩后初乳中抗体成分的下降，作为动物早期防御肠道有害菌的第一道重要屏障，肠黏膜免疫对于保障仔猪健康显得尤为重要。仔猪肠道黏膜免疫的尽早建立，对于机体抵御肠道病原菌和维持健康具有重要的意义。有研究证明与无菌动物相比，正常饲养的动物肠道黏膜免疫系统更趋于完善[1]。早期菌群干预可以降低炎症，过敏性疾病的发生，对仔猪肠道发育及免疫系统具有重要的作用。
丁酸是由畜禽肠道微生物发酵而产生的一种短链脂肪酸。丁酸钠是正丁酸的钠盐，易溶于水，其水溶液pH为碱性，在动物体内可解离为丁酸根和钠离子[2]。大量研究表明，丁酸盐作为一种非常有效的饲料添加剂，在动物出生不久后适量添加，能够提高动物的生产性能，促进胃肠道的消化吸收[3]，保护肠道上皮细胞完整性，提高断奶仔猪肠黏膜屏障功能，改善肠道菌群结构，减少仔猪腹泻，降低经济损失。丁酸不仅作为肠道上皮的能源物质，促进肠细胞的增殖，丁酸及丁酸盐在炎症和肠道菌群方面也起着至关重要的作用[46]。Galfi[6]等人研究表明丁酸钠显著增加了生长猪的体增重，提高了饲料利用率，并且改变了肠道微生物的组成。Collier等[7]的报道也说明，在早期断奶仔猪的日粮中添加0.3%丁酸钠对肠道微生物区系产生的影响最大，显著增加乳酸杆菌在肠道中的比例。
目前已有关于丁酸钠在猪方面的研究主要集中在断奶和保育阶段，而对于新生仔猪的研究却鲜有报道。因此，本研究通过对新生仔猪口服灌注丁酸钠，旨在探究早期丁酸钠干预对新生仔猪肠道菌群及免疫系统的影响。
1 材料与方法
1.1 试验动物和试验设计
选取10窝三元杂交新生仔猪（杜×长×大），每窝1011头仔猪，随机分为两组，即对照组（CO组）和丁酸钠组（SB组），每组5个重复（窝）。在仔猪17日龄，丁酸钠组每头仔猪每天灌喂150 mmol/L丁酸钠20 mL（9：00和15：00各一次，每次10 mL）。对照组灌喂相同剂量的生理盐水，仔猪按照猪场常规管理饲养。
1.2 样品的采集与处理
于仔猪8日龄和21日龄，各重复随机抽取试验仔猪1头进行屠宰，取胃、回肠、结肠食糜样，储存于20℃中，用于提取DNA，采用实时荧光定量PCR技术进行绝对定量检测其总菌数量。采集回肠组织样，提取RNA，采用荧光定量PCR技术对炎症因子进行基因相对定量分析。
1.3 指标测定
1.3.1 Realtime PCR检测总菌数量
1.3.1.1 食糜样DNA的提取
称取约0.1 g解冻后的肠道内容物样至灭菌后的Eppendorf管中，加入1.5 mL的磷酸缓冲液溶液（pH=7.0），涡旋混合，13000 r/min离心5 min，除去上清，参照Dai等[8]的方法，先用珠磨法机械破碎样品，后用酚和氯仿/异戊醇提取其总DNA。
1.3.1.2 DNA纯度和浓度检测
取DNA 2 μL用Thermo Scientific NANODROP 1000分光光度计检测所提取的总DNA浓度和纯度。
1.3.1.3 Realtime PCR定量分析
使用ABI 7500 Realtime PCR仪（Applied Biosysterm）对肠道内容物样中总菌（Total bacteria）进行定量。以化脓拟杆菌（Bacteroides pyogenus）和厚壁菌的16S rRNA基因作为模板制作相应细菌定量的标注曲线。Realtime PCR反应体系为20 μL： 10 μL SYBR Green Supermix（TOYOBO），10 μmol/L的上下游引物各0.4 μL，2 μL样品DNA以及6.8 μL 无菌水。总菌引物序列为F：5`GTGSTGCAYGGYYGTCGTCA3；R：5`ACGTCRTCCMCNCCTTCCTC3。PCR反应程序为：95℃ 10 min，而后95℃ 30 s，60℃下退火及延伸1 min，40个循环。
1.3.2 实时荧光定量PCR相对定量炎症因子表达
1.3.2.1 回肠组织样RNA提取
（1）组织匀浆：从液氮中取出适量的空肠粘膜组织，放入1.5 mL的EP管中，机械匀浆1 min左右，之后室温放置5 min，使其充分裂解。在4℃下，12000 rpm/min离心10 min，取上清液于新的EP管中。（2）氯仿抽提：按照1 mL Trizol reagent加入200 μL氯仿的比例加入氯仿（氯仿：Trizol=1：5），剧烈震荡30 s，使其充分混匀，冰浴10 min，4℃下，12000 rpm/min离心10 min。（3）异丙醇沉淀RNA：小心吸取上层液到一个新的EP管中，加入等体积的预冷的异丙醇，漩涡混匀，冰浴10 min，4 ℃下，12000 rpm/min离心10 min。EP管下层可见RNA沉淀。（4）RNA沉淀洗涤：弃上清，按照1 mL Trizol加入1 mL 75%预冷的乙醇，轻微摇晃洗涤，随后4℃下，8000 rpm/min离心5 min，重复洗涤3次。（5）RNA重溶：弃去乙醇，用离心机甩液滴并用移液器小心吸弃残液，随后在室温条件下在超净台中风干至半透明，然后加入50 μL Rnasefree水，使RNA充分溶解，分装备用。
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