脂多糖对奶牛乳腺上皮细胞蛋白表达的影响
本研究通过LPS处理乳腺上皮细胞，采用同位素标记相对和绝对定量多重标记串联质谱技术（iTRAQ）系统，比较LPS作用下奶牛乳腺上皮细胞蛋白的差异表达情况。本试验挑选健康状况良好的中国荷斯坦奶牛作为实验原料的来源对象，建立一个无菌环境，在此条件下对乳腺组织进行采集，然后在DMEM培养液中。采取组织块接种法对奶牛乳腺上皮细胞进行培养。采用LPS处理乳腺上皮细胞后，通过iTRAQ的方法测定差异表达蛋白。结果发现，与对照组相比有163蛋白表达上调， 178蛋白表达下调；应用ELISA方法测定细胞培养液中酪蛋白和脂肪酸合酶的浓度结果显示，LPS诱导组细胞培养液中上述蛋白的浓度明显低于对照组（P<0.05）。通过本研究表明LPS诱导的炎症反应可能会乳腺上皮细胞的乳蛋白和乳脂肪的合成产生一定的影响。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2试剂2
1.3仪器2
1.4实验方法3
1.4.1奶牛乳腺上皮细胞的分离培养3
1.4.2 奶牛乳腺上皮细胞的纯化3
1.4.3奶牛乳腺上皮细胞的鉴定3
1.4.4奶牛乳腺上皮细胞的传代培养3
1.4.5细胞处理3
1.4.6 蛋白质提取消化..........3
1.4.7 iTRAQ标记及高效液相色谱法分离肽段.....3
1.4.8 LCMS/MS 质谱检测与数据处理.......3?
1.4.9 ELISA检测细胞培养液中αs1酪蛋白、κ酪蛋白及脂肪酸合成酶（FSAN）浓度.......3
1.5统计方法3
2 结果与分析3
2.1奶牛乳腺上皮细胞形态学观察及鉴定4
2.2 LPS 对奶牛乳腺上皮细胞蛋白表达谱的影响5
2.3 LPS对培养上清中酪蛋白表达的影响6
2.4 LPS对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白表达的影响6
3讨论 6
4结论 8
致谢 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
8
参考文献8
图1牛乳腺上皮细胞形态观察及鉴定.....5
图2培养上清中αs1酪蛋白和κ酪蛋白的浓度.....6
图3培养上清中脂肪酸合成酶的浓度..................................6
脂多糖对奶牛乳腺上皮细胞蛋白表达的影响
引言
众所周知，乳腺炎是奶牛经常发生的一种疾病，其不仅引起奶产量下降，而且严重影响乳的品质，甚至危害到我们人类的健康，据统计乳腺炎是奶牛养殖行业中造成经济损失最大的疾病之一。根据其临床病症可以将乳腺炎分为隐性型乳房炎和临床型乳房炎，从发病率来看隐性乳房炎的发病率高于临床型乳腺炎，但是从病症主要特征来看患临床型乳腺炎后乳房会表现为乳腺温度上升、红肿、乳腺发生肿胀、乳腺组织损伤，而隐性乳腺炎没有明显临床症状，通常要通过CMT检测还能测定出来。不论奶牛患何种乳腺炎后，都会导致乳腺上皮细胞合成和分泌功能异常等不同程度障碍，严重的情况时会发现乳块、坏乳，轻微时乳糖、乳脂肪和乳蛋白等主要乳成分的合成量明显减少，最后导致牛奶品质显著下降[13]。
奶牛患上临床型乳腺炎是由多种原因引起的，其中大肠杆菌，作为一种常见的病原菌，则是引起奶牛感染临床型乳腺炎的最主要的原因。大肠杆菌中主要的致病成分就是脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS），其是革兰氏阴性菌细胞壁上的外膜[4]。如果乳腺中的大肠杆菌数量增加，那么这种外膜成分脂多糖在乳腺中存在就会越多，从而导致严重的临床型炎症发生。另外，脂多糖可作为一种高效的促炎反应因子[4,5]，其可以激发动物机体产生应激蛋白和炎性因子，从而进一步导致机体炎症反应发生。如果乳腺发生炎症，其组织内分泌调控模式会发生改变，同时乳腺泌乳营养代谢模式也会随之发生变化，对乳蛋白、乳脂肪的合成和含量有很大的影响[1,4,6]。
当外源细菌入侵乳腺时，首先是通过乳头管进入乳腺。挤奶操作不规范、环境病原菌多等因素都会导致细菌进入乳腺。细菌进入乳腺后首先与乳腺上皮细胞接触，所以乳腺上皮细胞就成为防御病原菌入侵的第一道防线[7]，研究表明乳腺上皮细胞在局部抵御、免疫应答、合成及分泌乳汁中都充分起到关键作用[13]。目前在实验室对乳腺的研究主要是采用乳腺组织外植体培养、乳腺上皮培养等方法，在体外建立乳腺模拟模型，从乳腺分泌、炎症发生等方面进行了研究[810]。本研究选取了乳腺功能良好的中国荷斯坦牛（无乳腺炎症，处于泌乳期）采集其乳腺组织，在DMEM培养液中采用组织块接种法对牛乳腺上皮细胞进行培养。通过LPS处理乳腺上皮细胞后，将3头奶牛的乳腺细胞混合，处理后的乳腺上皮细胞采用同位素标记相对和绝对定量技术分析脂多糖处理后基因在蛋白水平的表达谱，了解大肠杆菌对乳腺分泌的影响，为揭示革兰氏阴性菌导致的临床型乳腺炎对奶牛乳腺功能影响机制提供相关的理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料
从江苏省南京市江宁区汤山屠宰场选取中国荷斯坦奶牛的乳腺（对于有乳腺炎症、无泌乳腺泡的乳腺组织舍弃不采），采集乳腺组织（采集过程中要注意无菌或尽量减少与细菌接触），将采集后乳腺组织放在装有培养液的样品瓶中（培养液体中要含有含链、青霉素的双抗），尽快将组织带回实验室开展组织培养。具体的培养方法参考实验室建立的成熟方法[4]。
1.2 试剂
所用试剂见下表。
名称
备注
大肠杆菌内毒素（LPS）
sigma公司
MTT
sigma公司
DMEM液体培养基
Gbico公司
胎牛血清（FBS）
Gbico公司
胰蛋白酶（Trypsin）
sigma公司
青链霉素
Gibco公司
Betatubilin抗体
Santa Cruz公司
RIPA蛋白裂解液
碧云天公司
PMSF、BCA蛋白浓度试剂盒
碧云天公司
角蛋白18单克隆抗体
武汉博士德
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG
碧云天公司
其它试剂均为国产分析纯
1.3 仪器
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2试剂2
1.3仪器2
1.4实验方法3
1.4.1奶牛乳腺上皮细胞的分离培养3
1.4.2 奶牛乳腺上皮细胞的纯化3
1.4.3奶牛乳腺上皮细胞的鉴定3
1.4.4奶牛乳腺上皮细胞的传代培养3
1.4.5细胞处理3
1.4.6 蛋白质提取消化..........3
1.4.7 iTRAQ标记及高效液相色谱法分离肽段.....3
1.4.8 LCMS/MS 质谱检测与数据处理.......3?
1.4.9 ELISA检测细胞培养液中αs1酪蛋白、κ酪蛋白及脂肪酸合成酶（FSAN）浓度.......3
1.5统计方法3
2 结果与分析3
2.1奶牛乳腺上皮细胞形态学观察及鉴定4
2.2 LPS 对奶牛乳腺上皮细胞蛋白表达谱的影响5
2.3 LPS对培养上清中酪蛋白表达的影响6
2.4 LPS对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白表达的影响6
3讨论 6
4结论 8
致谢 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
8
参考文献8
图1牛乳腺上皮细胞形态观察及鉴定.....5
图2培养上清中αs1酪蛋白和κ酪蛋白的浓度.....6
图3培养上清中脂肪酸合成酶的浓度..................................6
脂多糖对奶牛乳腺上皮细胞蛋白表达的影响
引言
众所周知，乳腺炎是奶牛经常发生的一种疾病，其不仅引起奶产量下降，而且严重影响乳的品质，甚至危害到我们人类的健康，据统计乳腺炎是奶牛养殖行业中造成经济损失最大的疾病之一。根据其临床病症可以将乳腺炎分为隐性型乳房炎和临床型乳房炎，从发病率来看隐性乳房炎的发病率高于临床型乳腺炎，但是从病症主要特征来看患临床型乳腺炎后乳房会表现为乳腺温度上升、红肿、乳腺发生肿胀、乳腺组织损伤，而隐性乳腺炎没有明显临床症状，通常要通过CMT检测还能测定出来。不论奶牛患何种乳腺炎后，都会导致乳腺上皮细胞合成和分泌功能异常等不同程度障碍，严重的情况时会发现乳块、坏乳，轻微时乳糖、乳脂肪和乳蛋白等主要乳成分的合成量明显减少，最后导致牛奶品质显著下降[13]。
奶牛患上临床型乳腺炎是由多种原因引起的，其中大肠杆菌，作为一种常见的病原菌，则是引起奶牛感染临床型乳腺炎的最主要的原因。大肠杆菌中主要的致病成分就是脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS），其是革兰氏阴性菌细胞壁上的外膜[4]。如果乳腺中的大肠杆菌数量增加，那么这种外膜成分脂多糖在乳腺中存在就会越多，从而导致严重的临床型炎症发生。另外，脂多糖可作为一种高效的促炎反应因子[4,5]，其可以激发动物机体产生应激蛋白和炎性因子，从而进一步导致机体炎症反应发生。如果乳腺发生炎症，其组织内分泌调控模式会发生改变，同时乳腺泌乳营养代谢模式也会随之发生变化，对乳蛋白、乳脂肪的合成和含量有很大的影响[1,4,6]。
当外源细菌入侵乳腺时，首先是通过乳头管进入乳腺。挤奶操作不规范、环境病原菌多等因素都会导致细菌进入乳腺。细菌进入乳腺后首先与乳腺上皮细胞接触，所以乳腺上皮细胞就成为防御病原菌入侵的第一道防线[7]，研究表明乳腺上皮细胞在局部抵御、免疫应答、合成及分泌乳汁中都充分起到关键作用[13]。目前在实验室对乳腺的研究主要是采用乳腺组织外植体培养、乳腺上皮培养等方法，在体外建立乳腺模拟模型，从乳腺分泌、炎症发生等方面进行了研究[810]。本研究选取了乳腺功能良好的中国荷斯坦牛（无乳腺炎症，处于泌乳期）采集其乳腺组织，在DMEM培养液中采用组织块接种法对牛乳腺上皮细胞进行培养。通过LPS处理乳腺上皮细胞后，将3头奶牛的乳腺细胞混合，处理后的乳腺上皮细胞采用同位素标记相对和绝对定量技术分析脂多糖处理后基因在蛋白水平的表达谱，了解大肠杆菌对乳腺分泌的影响，为揭示革兰氏阴性菌导致的临床型乳腺炎对奶牛乳腺功能影响机制提供相关的理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料
从江苏省南京市江宁区汤山屠宰场选取中国荷斯坦奶牛的乳腺（对于有乳腺炎症、无泌乳腺泡的乳腺组织舍弃不采），采集乳腺组织（采集过程中要注意无菌或尽量减少与细菌接触），将采集后乳腺组织放在装有培养液的样品瓶中（培养液体中要含有含链、青霉素的双抗），尽快将组织带回实验室开展组织培养。具体的培养方法参考实验室建立的成熟方法[4]。
1.2 试剂
所用试剂见下表。
名称
备注
大肠杆菌内毒素（LPS）
sigma公司
MTT
sigma公司
DMEM液体培养基
Gbico公司
胎牛血清（FBS）
Gbico公司
胰蛋白酶（Trypsin）
sigma公司
青链霉素
Gibco公司
Betatubilin抗体
Santa Cruz公司
RIPA蛋白裂解液
碧云天公司
PMSF、BCA蛋白浓度试剂盒
碧云天公司
角蛋白18单克隆抗体
武汉博士德
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG
碧云天公司
其它试剂均为国产分析纯
1.3 仪器
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