鸭坦布苏病毒核衣壳蛋白的原核表达
本研究根据鸭坦布苏病毒JS804株基因序列，采用RT-PCR方法扩增出了鸭坦布苏病毒的C基因，将其克隆至原核表达载体pGEX-4t-1，构建了重组表达质粒pGEX-4t-1-C。再将其转化大肠杆菌E. coli BL21(DE3)，经IPTG诱导进行表达，最后优化表达条件。结果表明，鸭坦布苏病毒C基因在大肠杆菌中获得高效表达，核衣壳蛋白分子质量约为37KD，并且在5h时蛋白的表达量最高。优化表达实验发现当IPTG浓度为1mM时，蛋白表达量最高。鸭坦布苏病毒核衣壳蛋白的原核表达为进一步研究该蛋白的功能提供物质基础，并为该病的血清学诊断以及疫苗的研发提供候选抗原。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 病毒、菌种、克隆载体 2
1.1.2 实验试剂与耗材2
1.1.3 主要仪器设备2
1.2 方法 2
1.2.1 鸭坦布苏病毒基因组RNA的提取2
1.2.2 反转录合成第一链cDNA2
1.2.3 PCR扩增cDNA片段2
1.2.4 PCR产物纯化3
1.2.5 连接 3
1.2.6 感受态大肠杆菌DH5α的制备 3
1.2.7 转化3
1.2.8 重组质粒的制备3
1.2.9 重组质粒的酶切、PCR双重鉴定4
1.2.10 C基因重组原核表达载体的构建及鉴定4
1.2.11 核衣壳蛋白的原核表达4
1.2.12 重组蛋白表达条件的优化5
2 结果与分析5
2.1 鸭坦布苏病毒JS804株C基因的PCR扩增5
2.2 鸭坦布苏病毒JS804株C基因的酶切鉴定5
2.3 鸭坦布苏病毒JS804株C基因重组原核表达载体的构建5
2.4 C蛋白时间梯度诱导表达分析6
2.5 重组蛋白表达条件的优化6
3 讨论 7
致谢8
参考文献8< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
br /> 鸭坦布苏病毒核衣壳蛋白的原核表达
引言
随着我国经济的快速发展，养殖业越来越成为增加我国农民收入的一种重要产业。2010年春季我国新出现了一种导致鸭产蛋量急剧下降的传染病，即鸭坦布苏病毒病，其在我国华东地区首次发生，现在已经传播到我国大部分水禽养殖地区。该病的主要临床症状表现为发热，食欲下降，运动障碍，产蛋量急剧下降，后期表现为神经症状，共济失调，甚至瘫痪。其病理变化表现为卵泡出血、变性和破裂。统计发现，该病的病死率在5%~30%之间，而发病率则可高达100%[1]。目前已证实，引起该病的病原为鸭坦布苏病毒。
鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)属黄病毒科、黄病毒属，是不分节段的单股正链RNA病毒，其大小为50nm左右。DTMUV基因组包含一个长的开放阅读框，编码约含3400个氨基酸残基的聚蛋白分子。聚蛋白经蛋白酶剪切加工可以得到衣壳(capsid，C)蛋白、prM蛋白和包膜E蛋白3种结构蛋白及7种非结构蛋白。其中C蛋白是病毒颗粒的构成成分之一，可以以多拷贝的形式与单拷贝的病毒基因组RNA共同构成病毒的核衣壳(nucleocapsid)[4]。
本研究首次对鸭坦布苏病毒的核衣壳蛋白进行克隆和原核表达，并对表达条件进行优化，为进一步研究该蛋白的功能、抗体的制备及疫苗的研究奠定了理论基础，从而能够更好地预防鸭坦布苏病毒病，进而发展我国的禽类养殖业。
1 材料与方法
1．1 材料
主要包括病毒、菌种、克隆载体，实验试剂与耗材，主要仪器设备。
1．1．1 病毒、菌种、克隆载体 鸭坦布苏病毒分离株JS804株，由江苏省农业科学院兽医研究所禽病研究室分离；克隆用载体为pMD18T Vector，购自大连宝（TaKaRa）生物工程有限公司；表达载体pGEX4t1，由禽病研究室保存；大肠杆菌DH5α、BL21（DE3），由江苏省农业科学院兽医研究所禽病研究室保存。
1．1．2 实验试剂与耗材 AMV Reverse Transcriptase 、Random Primer（9mer）、Ex Taq聚合酶、DNA DL 2000 Marker、DNA DL 15000 Marker及各种限制性核酸内切酶（EcoR I、Sal I ）、异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）、T4 DNA Ligase均为TaKaRa公司产品；LB Broth、氨苄青霉素（Amp）均购自MDBio公司；Fluid viral DNA/RNA extraction kit、DNA gel extraction Kit、质粒小量提取试剂盒购自杭州AxyGen公司；乙醇、异丙醇等其他试剂均为分析纯试剂。
1．1．3 主要仪器设备 Telstar BIO ⅡA二级生物安全柜（超净台）；THZC台式恒温振荡器（太仓市华美生化仪器厂）；TaKaRa TP600 PCR仪；Eppendorf高速冷冻离心机；LX100手掌型离心机（江苏海门麒麟医用仪器厂）；AA200精密电子天平（香港华嘉仪器有限公司）；DNP9162A电热恒温培养箱（上海光都仪器设备有限公司）；培清JS680B全自动凝胶成像分析仪；DYA型电泳仪（上海西巴斯生物开发有限公司）；电泳槽（BioRad MiniPROTEINY3）；小型TransBlot转印槽（BioRad）；基础电源（BioRad PowerPac）；DK8D电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司）；TY80S脱色摇床（南京新校园生物技术研究所）；Eppendorf微量移液器；4℃冷藏冰箱、20℃冷冻冰柜，海尔公司产品。
1．2 方法
1．2．1 鸭坦布苏病毒基因组RNA的提取 用RNA提取试剂盒（Axygen公司）对鸭坦布苏病毒JS804株的RNA进行提取。具体操作如下：取200μL鸭坦布苏病毒JS804株样品，转入1.5mL离心管。加入200μL Buffer VL，漩涡振荡混匀，静置5min。再加75μL Buffer VN，漩涡振荡混匀，12000×g，离心5min。然后将上清转入新的2mL离心管，加300μL异丙醇（1%冰乙酸），上下颠倒68次混匀。将制备管置于2mL离心管中后，再将混合液转入制备管中，6000×g，离心1min，弃滤液。将制备管置回2mL离心管，加500μL Buffer W1A后，静置1min，12000×g，离心1min，弃滤液。将制备管置回2mL离心管，加800μL Buffer W2，12000×g，离心1min。将制备管置回2mL离心管，12000×g，离心1min。将制备管置于洁净的1.5mL离心管，在制备管膜中央加15μL Buffer TE，静置1min，12000×g，1min洗脱RNA。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 病毒、菌种、克隆载体 2
1.1.2 实验试剂与耗材2
1.1.3 主要仪器设备2
1.2 方法 2
1.2.1 鸭坦布苏病毒基因组RNA的提取2
1.2.2 反转录合成第一链cDNA2
1.2.3 PCR扩增cDNA片段2
1.2.4 PCR产物纯化3
1.2.5 连接 3
1.2.6 感受态大肠杆菌DH5α的制备 3
1.2.7 转化3
1.2.8 重组质粒的制备3
1.2.9 重组质粒的酶切、PCR双重鉴定4
1.2.10 C基因重组原核表达载体的构建及鉴定4
1.2.11 核衣壳蛋白的原核表达4
1.2.12 重组蛋白表达条件的优化5
2 结果与分析5
2.1 鸭坦布苏病毒JS804株C基因的PCR扩增5
2.2 鸭坦布苏病毒JS804株C基因的酶切鉴定5
2.3 鸭坦布苏病毒JS804株C基因重组原核表达载体的构建5
2.4 C蛋白时间梯度诱导表达分析6
2.5 重组蛋白表达条件的优化6
3 讨论 7
致谢8
参考文献8< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
br /> 鸭坦布苏病毒核衣壳蛋白的原核表达
引言
随着我国经济的快速发展，养殖业越来越成为增加我国农民收入的一种重要产业。2010年春季我国新出现了一种导致鸭产蛋量急剧下降的传染病，即鸭坦布苏病毒病，其在我国华东地区首次发生，现在已经传播到我国大部分水禽养殖地区。该病的主要临床症状表现为发热，食欲下降，运动障碍，产蛋量急剧下降，后期表现为神经症状，共济失调，甚至瘫痪。其病理变化表现为卵泡出血、变性和破裂。统计发现，该病的病死率在5%~30%之间，而发病率则可高达100%[1]。目前已证实，引起该病的病原为鸭坦布苏病毒。
鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus，DTMUV)属黄病毒科、黄病毒属，是不分节段的单股正链RNA病毒，其大小为50nm左右。DTMUV基因组包含一个长的开放阅读框，编码约含3400个氨基酸残基的聚蛋白分子。聚蛋白经蛋白酶剪切加工可以得到衣壳(capsid，C)蛋白、prM蛋白和包膜E蛋白3种结构蛋白及7种非结构蛋白。其中C蛋白是病毒颗粒的构成成分之一，可以以多拷贝的形式与单拷贝的病毒基因组RNA共同构成病毒的核衣壳(nucleocapsid)[4]。
本研究首次对鸭坦布苏病毒的核衣壳蛋白进行克隆和原核表达，并对表达条件进行优化，为进一步研究该蛋白的功能、抗体的制备及疫苗的研究奠定了理论基础，从而能够更好地预防鸭坦布苏病毒病，进而发展我国的禽类养殖业。
1 材料与方法
1．1 材料
主要包括病毒、菌种、克隆载体，实验试剂与耗材，主要仪器设备。
1．1．1 病毒、菌种、克隆载体 鸭坦布苏病毒分离株JS804株，由江苏省农业科学院兽医研究所禽病研究室分离；克隆用载体为pMD18T Vector，购自大连宝（TaKaRa）生物工程有限公司；表达载体pGEX4t1，由禽病研究室保存；大肠杆菌DH5α、BL21（DE3），由江苏省农业科学院兽医研究所禽病研究室保存。
1．1．2 实验试剂与耗材 AMV Reverse Transcriptase 、Random Primer（9mer）、Ex Taq聚合酶、DNA DL 2000 Marker、DNA DL 15000 Marker及各种限制性核酸内切酶（EcoR I、Sal I ）、异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）、T4 DNA Ligase均为TaKaRa公司产品；LB Broth、氨苄青霉素（Amp）均购自MDBio公司；Fluid viral DNA/RNA extraction kit、DNA gel extraction Kit、质粒小量提取试剂盒购自杭州AxyGen公司；乙醇、异丙醇等其他试剂均为分析纯试剂。
1．1．3 主要仪器设备 Telstar BIO ⅡA二级生物安全柜（超净台）；THZC台式恒温振荡器（太仓市华美生化仪器厂）；TaKaRa TP600 PCR仪；Eppendorf高速冷冻离心机；LX100手掌型离心机（江苏海门麒麟医用仪器厂）；AA200精密电子天平（香港华嘉仪器有限公司）；DNP9162A电热恒温培养箱（上海光都仪器设备有限公司）；培清JS680B全自动凝胶成像分析仪；DYA型电泳仪（上海西巴斯生物开发有限公司）；电泳槽（BioRad MiniPROTEINY3）；小型TransBlot转印槽（BioRad）；基础电源（BioRad PowerPac）；DK8D电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司）；TY80S脱色摇床（南京新校园生物技术研究所）；Eppendorf微量移液器；4℃冷藏冰箱、20℃冷冻冰柜，海尔公司产品。
1．2 方法
1．2．1 鸭坦布苏病毒基因组RNA的提取 用RNA提取试剂盒（Axygen公司）对鸭坦布苏病毒JS804株的RNA进行提取。具体操作如下：取200μL鸭坦布苏病毒JS804株样品，转入1.5mL离心管。加入200μL Buffer VL，漩涡振荡混匀，静置5min。再加75μL Buffer VN，漩涡振荡混匀，12000×g，离心5min。然后将上清转入新的2mL离心管，加300μL异丙醇（1%冰乙酸），上下颠倒68次混匀。将制备管置于2mL离心管中后，再将混合液转入制备管中，6000×g，离心1min，弃滤液。将制备管置回2mL离心管，加500μL Buffer W1A后，静置1min，12000×g，离心1min，弃滤液。将制备管置回2mL离心管，加800μL Buffer W2，12000×g，离心1min。将制备管置回2mL离心管，12000×g，离心1min。将制备管置于洁净的1.5mL离心管，在制备管膜中央加15μL Buffer TE，静置1min，12000×g，1min洗脱RNA。
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