金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶的表达纯化及活性测定(附件)
1金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶用于防治多种金黄色葡萄球菌引起的疾病，本研究将裂解酶基因PPS1与分别嵌合了不同抗菌肽的嵌合裂解酶AP-LyS1、OPS1基因与pET32b原核表达载体合成重组表达质粒pET32b-PPS1、pET32b-AP-LyS1、pET32b-OPS1，将重组表达质粒转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞，以1mmol/L 的IPTG在不同条件下诱导实现了高效表达，并且确定了最佳表达条件。使用破坏细菌细胞壁、细胞膜的物质，促进外泌表达，提高蛋白表达产量。选择活性相对最高的AP-LyS1裂解酶蛋白，采用His标签亲和层析镍柱纯化目的蛋白，用PMB柱等法去内毒素，纯化目的蛋白，点板法显示AP-LyS1和OPS1活性较高，药敏实验测定AP-LyS1最低抑菌浓度，同时证实了嵌合裂解酶AP-LyS1与抗菌肽复合使用可显著提高裂解活性，为新型抗菌药的开发提供了理论基础。
目录
引言
金黄色葡萄球菌是环境中普遍存在的革兰氏阳性菌，致病能力强。在畜牧业金黄色葡萄球菌是引起仔猪腹泻、伤口感染及奶牛乳腺炎的主要致病菌之一，近年来随着抗生素的使用日益增多，金黄色葡萄球菌的耐药性也不断增强，同时由于人们对食品中抗生素残留问题的担忧，导致寻找新的抗菌剂势在必行[1]。
噬菌体又称细菌病毒，是一种在细菌体内完成自我生长和增殖、通过裂解细菌将自身释放到坏境中的微小生物，因其识别宿主的专一性，不会对其他细菌造成杀伤，因此不会产生残留危害的问题，且对机体使用噬菌体无副作用，细菌对于噬菌体也很难产生抗性，因此，噬菌体被认为是治疗细菌感染和环境消毒的有效手段。
在噬菌体发现之初，研究者们便意识到它在细菌性疾病防制方面的应用价值，故做了大量试验研究噬菌体的生物学特性。但是随着抗生素的出现，相关研究被中断。当前随着耐药菌株的不断出现及人们生物安全观念的不断深化，噬菌体在细菌疾病方面的应用价值被重新重视起来[2]。早在1915年及1917年，英国著名的细菌学家 Twort与法国的dherelle分别发现了噬菌体的存在[34]。噬菌体分为烈性及温和性噬菌体，烈性噬菌体可在敏感宿主菌内增殖，并使之裂解，也称为毒性噬菌体。温和性噬菌体基因组整合于宿主菌基因组中，成为细菌 DNA 的一部分，和宿主核酸同步复制，宿主细胞 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
不裂解而继续生长。
裂解酶( Lysin) 是双链 DNA 噬菌体在感染细菌后期所产生的一种肽聚糖水解酶[5]，是噬菌体裂解细菌的关键成分。现有报道，裂解酶在许多实验中表现出良好的裂菌效果[67]。同时，随着医学和生物学的迅猛发展，人们对于疾病的认识越来越深，对于噬菌体基因组的研究使得人们对噬菌体的认识也不断加深。通过基因工程手段改造噬菌体和根据噬菌体开发新型抗菌药物取得了很大进展。噬菌体裂解酶是由噬菌体合并对细菌细胞壁中肽聚糖有裂解作用的酶，对于革兰氏阳性菌在细菌体外依旧能起到破坏其细胞壁导致细菌裂解，其同时具有噬菌体无毒副作用的优点，同时裂解酶的抗菌谱比噬菌体的抗菌谱范围广，具有有巨大的潜在应用价值。
在前期工作中，本课题组分离到1株金黄色葡萄球菌噬菌体，裂解能力较强。通过构建重组表达载体，获得含重组表达质粒的表达菌种，并以此重组质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞。本研究诱导表达了裂解酶基因PPS1与分别嵌合了不同抗菌肽的嵌合裂解酶APLyS1、OPS1基因，并对其表达条件进行优化，尝试通过破壁破膜促进外泌表达，选择裂解活性高的蛋白使用His亲和层析镍柱对目的进行纯化，同时用PMB去内毒素纯化柱、1%曲拉通进行去内毒素纯化，对纯化后的蛋白的内毒素含量进行测定，并且对纯化后的目的蛋白活性进行测定，期望为开发新型抗菌药物奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1菌株
金黄色葡萄球菌标准菌种：ATCC25923、CMCC26001（此实验室购自美国菌种保藏中心和中国医学微生物菌种保藏管理中心）；
本实验室分离鉴定保存菌种： YZ17；
重组菌液（利用嵌合裂解酶APLyS1基因分别与pET32b原核表达载体合成重组表达质粒PET32bAPLyS1、pET32bPPS1、pET32bOPS1，将重组表达质粒导入转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中，涂布含有50μg/mL氨苄抗生素LB平板上，37 ℃培养过夜，挑取阳性克隆接种于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养过夜，获得三种重组菌液，加甘油20℃冻存）。
1.1.2器材
超微量紫外可见分光光度计（购自NanoVue公司）；电热恒温水槽（购自上海精宏实验设备有限公司）；恒温混匀仪、离心机（购自eppendorf公司）；凝胶成像系统、梯度PCR仪、电转印槽（购自BIORAD公司）；电泳仪电源购自北京市六一仪器厂；洁净工作台购自苏州真田洁净设备有限公司；生物安全柜（购自苏州安泰空气技术有限公司）；DHP9025型电热恒温培养箱（购自上海一恒科技有限公司）；DRP9082型电热恒温培养箱（购自上海森信实验仪器有限公司）；HYLC组合式摇床、HZLF160全温振荡培养箱（购自太仓市强乐实验设备有限公司）；电子天平（购自HANGPING公司）；高压灭菌锅（购自南京基天生物技术有限责任公司）；微量移液枪（购自Thermo公司、Finnpipette公司和PhysioCare公司）。
1.1.3试剂与试剂盒
His亲和层析镍柱（GE Healthcare, Sweden）、PMB去内毒素层析柱（购自 GenScript公司）、内毒素含量检测试剂盒（购自 GenScript生物科技有限公司）、LB营养琼脂、LB肉汤琼脂粉（购自北京奥博星生物技术有限责任公司）、蛋白预制胶、蛋白电泳液MOPS（购自GenScript生物科技有限公司）、乳酸链球菌素、甘氨酸、蛋白冻干粉（多肽）。
1.2 方法
1.2.1转化
①Rosetta(DE3)感受态细胞从80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀（避免用枪吸打），冰中静置25分钟。
②42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
③向离心管中加入700μL不含抗生素的无菌培养基（LB），混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。
④将菌液100μL涂布到含氨苄青霉素的LB固体培养基上
⑤将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。挑取阳性克隆接种于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养过夜，获得三种重组菌液，加甘油20℃冻存。
1.2.2目的基因PPS1、APLyS1、OPS1的诱导表达
取扩增好的PET32bAPLyS1、PET32bPPS1、PET32bOPS1重组菌液2 m L加入198 m L氨苄青霉素（200μL）液体LB培养基中，在37 ℃的温度中以200 r/min转速大量培养，到OD600值为 0.40. 6 时加入终浓度为 1 mmol/L的IPTG 200μL，在20 ℃的恒温培养箱中以200 r/min转速诱导表达20h。离心收集菌体于20℃保存。
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引言
金黄色葡萄球菌是环境中普遍存在的革兰氏阳性菌，致病能力强。在畜牧业金黄色葡萄球菌是引起仔猪腹泻、伤口感染及奶牛乳腺炎的主要致病菌之一，近年来随着抗生素的使用日益增多，金黄色葡萄球菌的耐药性也不断增强，同时由于人们对食品中抗生素残留问题的担忧，导致寻找新的抗菌剂势在必行[1]。
噬菌体又称细菌病毒，是一种在细菌体内完成自我生长和增殖、通过裂解细菌将自身释放到坏境中的微小生物，因其识别宿主的专一性，不会对其他细菌造成杀伤，因此不会产生残留危害的问题，且对机体使用噬菌体无副作用，细菌对于噬菌体也很难产生抗性，因此，噬菌体被认为是治疗细菌感染和环境消毒的有效手段。
在噬菌体发现之初，研究者们便意识到它在细菌性疾病防制方面的应用价值，故做了大量试验研究噬菌体的生物学特性。但是随着抗生素的出现，相关研究被中断。当前随着耐药菌株的不断出现及人们生物安全观念的不断深化，噬菌体在细菌疾病方面的应用价值被重新重视起来[2]。早在1915年及1917年，英国著名的细菌学家 Twort与法国的dherelle分别发现了噬菌体的存在[34]。噬菌体分为烈性及温和性噬菌体，烈性噬菌体可在敏感宿主菌内增殖，并使之裂解，也称为毒性噬菌体。温和性噬菌体基因组整合于宿主菌基因组中，成为细菌 DNA 的一部分，和宿主核酸同步复制，宿主细胞 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
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裂解酶( Lysin) 是双链 DNA 噬菌体在感染细菌后期所产生的一种肽聚糖水解酶[5]，是噬菌体裂解细菌的关键成分。现有报道，裂解酶在许多实验中表现出良好的裂菌效果[67]。同时，随着医学和生物学的迅猛发展，人们对于疾病的认识越来越深，对于噬菌体基因组的研究使得人们对噬菌体的认识也不断加深。通过基因工程手段改造噬菌体和根据噬菌体开发新型抗菌药物取得了很大进展。噬菌体裂解酶是由噬菌体合并对细菌细胞壁中肽聚糖有裂解作用的酶，对于革兰氏阳性菌在细菌体外依旧能起到破坏其细胞壁导致细菌裂解，其同时具有噬菌体无毒副作用的优点，同时裂解酶的抗菌谱比噬菌体的抗菌谱范围广，具有有巨大的潜在应用价值。
在前期工作中，本课题组分离到1株金黄色葡萄球菌噬菌体，裂解能力较强。通过构建重组表达载体，获得含重组表达质粒的表达菌种，并以此重组质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞。本研究诱导表达了裂解酶基因PPS1与分别嵌合了不同抗菌肽的嵌合裂解酶APLyS1、OPS1基因，并对其表达条件进行优化，尝试通过破壁破膜促进外泌表达，选择裂解活性高的蛋白使用His亲和层析镍柱对目的进行纯化，同时用PMB去内毒素纯化柱、1%曲拉通进行去内毒素纯化，对纯化后的蛋白的内毒素含量进行测定，并且对纯化后的目的蛋白活性进行测定，期望为开发新型抗菌药物奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1菌株
金黄色葡萄球菌标准菌种：ATCC25923、CMCC26001（此实验室购自美国菌种保藏中心和中国医学微生物菌种保藏管理中心）；
本实验室分离鉴定保存菌种： YZ17；
重组菌液（利用嵌合裂解酶APLyS1基因分别与pET32b原核表达载体合成重组表达质粒PET32bAPLyS1、pET32bPPS1、pET32bOPS1，将重组表达质粒导入转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中，涂布含有50μg/mL氨苄抗生素LB平板上，37 ℃培养过夜，挑取阳性克隆接种于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养过夜，获得三种重组菌液，加甘油20℃冻存）。
1.1.2器材
超微量紫外可见分光光度计（购自NanoVue公司）；电热恒温水槽（购自上海精宏实验设备有限公司）；恒温混匀仪、离心机（购自eppendorf公司）；凝胶成像系统、梯度PCR仪、电转印槽（购自BIORAD公司）；电泳仪电源购自北京市六一仪器厂；洁净工作台购自苏州真田洁净设备有限公司；生物安全柜（购自苏州安泰空气技术有限公司）；DHP9025型电热恒温培养箱（购自上海一恒科技有限公司）；DRP9082型电热恒温培养箱（购自上海森信实验仪器有限公司）；HYLC组合式摇床、HZLF160全温振荡培养箱（购自太仓市强乐实验设备有限公司）；电子天平（购自HANGPING公司）；高压灭菌锅（购自南京基天生物技术有限责任公司）；微量移液枪（购自Thermo公司、Finnpipette公司和PhysioCare公司）。
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1.2 方法
1.2.1转化
①Rosetta(DE3)感受态细胞从80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀（避免用枪吸打），冰中静置25分钟。
②42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
③向离心管中加入700μL不含抗生素的无菌培养基（LB），混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。
④将菌液100μL涂布到含氨苄青霉素的LB固体培养基上
⑤将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。挑取阳性克隆接种于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养过夜，获得三种重组菌液，加甘油20℃冻存。
1.2.2目的基因PPS1、APLyS1、OPS1的诱导表达
取扩增好的PET32bAPLyS1、PET32bPPS1、PET32bOPS1重组菌液2 m L加入198 m L氨苄青霉素（200μL）液体LB培养基中，在37 ℃的温度中以200 r/min转速大量培养，到OD600值为 0.40. 6 时加入终浓度为 1 mmol/L的IPTG 200μL，在20 ℃的恒温培养箱中以200 r/min转速诱导表达20h。离心收集菌体于20℃保存。
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