利用厌氧真菌和甲烷菌共培养体系研究三硝酸丙酸酯对厌氧真菌代谢的影响
三硝酸丙酸酯（NG）的硝酸酯官能团（-O-NO2）能够氧化甲烷菌甲基辅酶M还原酶（MCR）的活性中心而阻断甲烷生成。本课题利用厌氧真菌和甲烷菌体外共培养体系，研究了NG对厌氧真菌和甲烷菌代谢的影响。结果显示，NG显著降低了厌氧真菌共培养和纯培养总产气量、甲烷产量、氢气产量、挥发性脂肪酸产量、乙醇、乳酸、甲酸、纤维水解酶酶活以及厌氧真菌和甲烷菌数量（P<0.05），但NG对厌氧真菌和甲烷菌的影响存在剂量效应。结论适宜剂量的NG 能够在不影响厌氧真菌活性的条件下抑制甲烷菌的活性。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料方法 2
1.1 研究材料 2
1.2试验方案 2
1.3化学分析 2
1.4微生物定量测定 2
1.5数据统计 3
2 结果分析 3
2.1 NG对总产气量、氢气和甲烷的影响 3
2.2 NG对代谢产物的影响 3
2.2.1 pH值变化 3
2.2.2甲酸、乳酸、乙醇浓度变化 3
2.2.3挥发性脂肪酸(VFA)浓度变化 4
2.2.4微生物数量的变化 4
3讨论 4
4 结论 7
致谢 7
参考文献 7
利用厌氧真菌和甲烷菌共培养体系研究三硝酸丙酸酯对厌氧真菌代谢的影响
引言
引言：在瘤胃微生物发酵过程中，会有2~12%的饲料能量以甲烷的形式排出体外[1]。瘤胃甲烷排放不仅是饲料能量的损失，还是仅次于CO2的第二大温室气体来源。因此，有效控制瘤胃甲烷排放对缓解温室效应和减少饲料能量损失具有积极意义。瘤胃内主要栖息着细菌、真菌、原虫和甲烷菌四个微生物菌群，在瘤胃微生物的协同作用下饲料被迅速降解为挥发性脂肪酸（VFA）、甲烷（CH4）、二氧化碳（CO2）等。目前对瘤胃甲烷的调控主要通过三个方面：营养、遗传育种和生产管理 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
。通过营养调控瘤胃甲烷产生的主要途径是在日粮中添加甲烷调控剂。目前常见的甲烷调控剂主要有：1）中长链脂肪酸[2]、多不饱和脂肪酸[3]和有机酸（苹果酸和富马酸丙酸等）；2）植物次级代谢物（精油、皂甙和单宁等）[46]；3）卤代甲烷类似物（溴氯甲烷，氯仿等）[79]；4）抗生素离子载体（莫能菌素和拉沙里菌素等）[10]。但目前这些甲烷调控剂在实际应用中存在不足：1）中长 链脂肪酸和多不饱和脂肪酸会影响饲料降解率；2）苹果酸和富马酸使用成本过高；3）植物次级代谢物长期使用抑制瘤胃CH4的效力减弱；4）卤代CH4类似物会影响动物健康；5）抗生素离子载体已被禁止添加到饲料中；6）筛选产CH4较低的动物品种周期较长，成本较高；7）除去原虫会影响瘤胃正常发酵。
最近含有硝酸酯（ONO2）官能团的一类化合物，因能够有效抑制甲烷的产量，成为研究的热点。研究表明通过对甲基辅酶M（CH3SCoM）还原酶的特异性抑制，能降低瘤胃甲烷的产生。3硝酸酯丙醇（3nitrooxypropanol，3NOP）是甲基辅酶M的类似物，其不仅能能够竞争底物结合位点，同时能够氧化MCR的活性中心位点使其由Ni（I）变为Ni（II）[11]，阻断甲烷的合成。最近的体内和体外研究表明，其能有效地控制瘤胃甲烷的产生，硝酸酯化合物除硝酸酯（ONO2）基团具有氧化性外，其还原产物亚硝酸盐也具有氧化甲基辅酶M的能力，因此在这种双重作用机制下，微量的硝酸酯化合物就能够有效抑制瘤胃甲烷的产生，具有较强的应用前景。
硝酸酯化合物对瘤胃甲烷的生成有较好的抑制效果，但对瘤胃重要的纤维降解菌厌氧真菌的影响尚不知晓，因此本课题利用厌氧真菌和甲烷菌体外共培养法研究了硝酸酯化合物NG对瘤胃厌氧真菌和甲烷菌代谢的影响，旨在为NG在反刍动物生产上的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 研究材料
NG购自北京益民药业有限公司。
接种来源于大学消化道微生物研究室: Piromyces sp. F1和Methanobrevibacter sp.。
1.2 试验方案
试验设立真菌纯培养组：分别添加NG 0、6.6、13.2、19.8 μm/L；真菌和甲烷菌共培养组：分别添加NG 0、6.6、13.2、19.8 μm/L。39℃静止发酵96 h。
培养基参照Theodorou等[12]的方法配置，由缓冲液、基础培养基、无细胞瘤胃液、还原剂和氧化还原指示剂组成。厌氧培养基配置完成后，分装到160 mL的发酵瓶中，每瓶装95 mL培养基。底物为1 g 粉碎稻草（长度约1 mm）。接种物为培养三天的厌氧真菌纯培养物和共培养物，接种量约为5 mL菌液。接种前根据真菌ITS基因拷贝数调节真菌纯培养和共培养液中的真菌浓度。
1.3化学分析
发酵结束后，立即测定总产气量、甲烷、氢气和pH。总产气量的测定参照Theodorou等[12]的方法，利用数字显示pH计（Ecoscan pH 5 Singapore）测定pH值。
挥发性脂肪酸浓度检测参照Pontes等13]的方法。
乳酸参照Barker & Summerson[14]方法测定。
1.4微生物定量测定
DNA提取参照MartínezFernández等[15]的方法。
微生物浓度定量分析采用SYBR? Premix Ex TagTM（TaKaRa）试剂和Applied Biosystems 7300 RealTime PCR System，对发酵液中真菌和甲烷菌浓度 进行定量。
表1 本研究使用PCR引物序列
Table 1 PCR primers used in this study
Target organisms
Sequence (5—3)
Annealing
temperature (℃)
Product
size (bp)
Reference
Archaea
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料方法 2
1.1 研究材料 2
1.2试验方案 2
1.3化学分析 2
1.4微生物定量测定 2
1.5数据统计 3
2 结果分析 3
2.1 NG对总产气量、氢气和甲烷的影响 3
2.2 NG对代谢产物的影响 3
2.2.1 pH值变化 3
2.2.2甲酸、乳酸、乙醇浓度变化 3
2.2.3挥发性脂肪酸(VFA)浓度变化 4
2.2.4微生物数量的变化 4
3讨论 4
4 结论 7
致谢 7
参考文献 7
利用厌氧真菌和甲烷菌共培养体系研究三硝酸丙酸酯对厌氧真菌代谢的影响
引言
引言：在瘤胃微生物发酵过程中，会有2~12%的饲料能量以甲烷的形式排出体外[1]。瘤胃甲烷排放不仅是饲料能量的损失，还是仅次于CO2的第二大温室气体来源。因此，有效控制瘤胃甲烷排放对缓解温室效应和减少饲料能量损失具有积极意义。瘤胃内主要栖息着细菌、真菌、原虫和甲烷菌四个微生物菌群，在瘤胃微生物的协同作用下饲料被迅速降解为挥发性脂肪酸（VFA）、甲烷（CH4）、二氧化碳（CO2）等。目前对瘤胃甲烷的调控主要通过三个方面：营养、遗传育种和生产管理 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
。通过营养调控瘤胃甲烷产生的主要途径是在日粮中添加甲烷调控剂。目前常见的甲烷调控剂主要有：1）中长链脂肪酸[2]、多不饱和脂肪酸[3]和有机酸（苹果酸和富马酸丙酸等）；2）植物次级代谢物（精油、皂甙和单宁等）[46]；3）卤代甲烷类似物（溴氯甲烷，氯仿等）[79]；4）抗生素离子载体（莫能菌素和拉沙里菌素等）[10]。但目前这些甲烷调控剂在实际应用中存在不足：1）中长 链脂肪酸和多不饱和脂肪酸会影响饲料降解率；2）苹果酸和富马酸使用成本过高；3）植物次级代谢物长期使用抑制瘤胃CH4的效力减弱；4）卤代CH4类似物会影响动物健康；5）抗生素离子载体已被禁止添加到饲料中；6）筛选产CH4较低的动物品种周期较长，成本较高；7）除去原虫会影响瘤胃正常发酵。
最近含有硝酸酯（ONO2）官能团的一类化合物，因能够有效抑制甲烷的产量，成为研究的热点。研究表明通过对甲基辅酶M（CH3SCoM）还原酶的特异性抑制，能降低瘤胃甲烷的产生。3硝酸酯丙醇（3nitrooxypropanol，3NOP）是甲基辅酶M的类似物，其不仅能能够竞争底物结合位点，同时能够氧化MCR的活性中心位点使其由Ni（I）变为Ni（II）[11]，阻断甲烷的合成。最近的体内和体外研究表明，其能有效地控制瘤胃甲烷的产生，硝酸酯化合物除硝酸酯（ONO2）基团具有氧化性外，其还原产物亚硝酸盐也具有氧化甲基辅酶M的能力，因此在这种双重作用机制下，微量的硝酸酯化合物就能够有效抑制瘤胃甲烷的产生，具有较强的应用前景。
硝酸酯化合物对瘤胃甲烷的生成有较好的抑制效果，但对瘤胃重要的纤维降解菌厌氧真菌的影响尚不知晓，因此本课题利用厌氧真菌和甲烷菌体外共培养法研究了硝酸酯化合物NG对瘤胃厌氧真菌和甲烷菌代谢的影响，旨在为NG在反刍动物生产上的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 研究材料
NG购自北京益民药业有限公司。
接种来源于大学消化道微生物研究室: Piromyces sp. F1和Methanobrevibacter sp.。
1.2 试验方案
试验设立真菌纯培养组：分别添加NG 0、6.6、13.2、19.8 μm/L；真菌和甲烷菌共培养组：分别添加NG 0、6.6、13.2、19.8 μm/L。39℃静止发酵96 h。
培养基参照Theodorou等[12]的方法配置，由缓冲液、基础培养基、无细胞瘤胃液、还原剂和氧化还原指示剂组成。厌氧培养基配置完成后，分装到160 mL的发酵瓶中，每瓶装95 mL培养基。底物为1 g 粉碎稻草（长度约1 mm）。接种物为培养三天的厌氧真菌纯培养物和共培养物，接种量约为5 mL菌液。接种前根据真菌ITS基因拷贝数调节真菌纯培养和共培养液中的真菌浓度。
1.3化学分析
发酵结束后，立即测定总产气量、甲烷、氢气和pH。总产气量的测定参照Theodorou等[12]的方法，利用数字显示pH计（Ecoscan pH 5 Singapore）测定pH值。
挥发性脂肪酸浓度检测参照Pontes等13]的方法。
乳酸参照Barker & Summerson[14]方法测定。
1.4微生物定量测定
DNA提取参照MartínezFernández等[15]的方法。
微生物浓度定量分析采用SYBR? Premix Ex TagTM（TaKaRa）试剂和Applied Biosystems 7300 RealTime PCR System，对发酵液中真菌和甲烷菌浓度 进行定量。
表1 本研究使用PCR引物序列
Table 1 PCR primers used in this study
Target organisms
Sequence (5—3)
Annealing
temperature (℃)
Product
size (bp)
Reference
Archaea
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