表达戊型肝炎病毒（hev）衣壳蛋白基因orf2的稳定细胞系的构建
本研究旨在建立可稳定表达戊型肝炎病毒（HEV）ORF2蛋白的Huh 7细胞系。采用PCR的方法，从质粒p6-1中克隆ORF2基因，构建PB转座子介导的真核表达载体pB-puro-513-ORF2；在脂质体的介导下，将pB-puro-513-ORF2载体和转座酶载体共转染Huh 7细胞，通过嘌呤霉素进行稳定筛选。并利用IFA和qRT-PCR鉴定ORF2基因在转录和翻译水平上表达。此外，转染试验表明PiggyBac转座子可在Huh 7细胞中发生高效转座。本研究为建立稳定的Huh 7转基因细胞系提供了一种高效的方法，并为下一步HEV的反式包装系统奠定了基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
前言 2
1材料与方法 3
1.1材料 3
1.1.1 质粒、菌株和细胞 质粒 3
1.1.2 工具酶和试剂 3
1.2 载体构建 3
1.2.1 质粒载体PB513，GFP基因的敲除 3
1.2.2 构建含有筛选基因的转基因载体PBHEVORF2112a606a 4
1.2.3 感受态细胞的制备 4
1.2.4 转化 5
1.2.5 pBpuro513ORF2载体的鉴定 5
1.2.6 质粒的提取 5
1.3在Hun 7细胞中表达ORF2蛋白 5
1.3.1细胞的准备 5
1.3.2转染 6
1.4 间接免疫荧光检测目的蛋白的表达及免疫活性 6
1.5 细胞中总RNA的提取及RTPCR扩增 6
1.5.1 用Trizol法提取Huh 7细胞总RNA 6
1.5.2 一步法qRTPCR扩增 6
2 结果与分析 7
2.1质粒的构建 7
2.1.1载体质粒中GFP的敲出 7
2.1.2目的基因ORF2的插入 7
2.2 Huh 7细胞嘌呤霉素最佳筛选浓度的测定 7
2.3 间接免疫荧光检测蛋白的表达 8
2.4 戊型肝炎病 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
毒ORF2 基因表达量变化 8
3 讨论 8
3.1 稳定表达HEV衣壳蛋白的细胞系与疫苗生产 8
3.2 为HEV的反式包装提供了蛋白材料 9
3.3 PB转座子将外源基因插入到细胞基因组染色体 9
致谢 10
参考文献 10
表1 Overlap PCR目的片段引物序列 4
图1 重组表达载体的构建 3
图2 菌落PCR鉴定重组质粒阳性率 7
表2 不同浓度嘌呤霉素对Huh 7细胞生长的影响 7
图3嘌呤霉素筛选第3天时Huh 7 细胞情况 7
图4 pBpuro513ORF2转染Huh 7细 8
图5 实验组和对照组细胞中目的基因的mRNA的表达量 8
表达戊型肝炎病毒（HEV）衣壳蛋白基因ORF2的稳定细胞系的构建
引言
引言 戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)是由前苏联学者Balayan于1983年首次用免疫电镜观察到的病毒颗粒[1]，在1989年被正式命名为HEV。目前在许多发展中国家，HEV引起了急性戊型肝炎的流行，与此同时，HEV也流行于一些发达国家。戊型肝炎是公认的人畜共患病，其传播途径是经粪口途径传播。目前HEV共有1、2、3、4型和禽、鼠、兔HEV，其中1型和2型HEV的主要感染对象是人类，可导致流行性戊型肝炎的发生；3型和4型HEV既可以感染人，也可以感染动物，猪是主要动物宿主[2]。禽和鼠HEV不感染人，兔HEV可跨种系传播[3]。
近年来，研究工作者对从动物体中分离得到的HEV样毒株的研究表明，该病毒有向人畜共患病转移的趋势。HEV是引起戊型肝炎的病原体，而戊型肝炎又是急性肝炎的主要形式，因此，对HEV的研究对于控制急性肝炎的传播具有十分重要的意义。这种疾病流行于亚洲、非洲和拉丁美洲的大部分地区[4]。估计全球有20亿人生活在戊型肝炎流行的地区。所有流行地区的共同特征是当地的饮用水被污染，患者经由口腔途径感染。最高的感染率出现在公共卫生和社会经济地位差的地区，表明若采取有效的公共卫生措施对该病的防控有很大的意义。次要的传播途径是垂直传播和血液传播。但研究表明，人和人通过相接触传播的效率很低[5]。
HEV是一种单链正股的非囊膜RNA病毒。HEV的基因组大小约为7.2 kb，包含3个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)。HEV基因组中的连接区域(Junction Region, JR)将ORF1与ORF2、ORF3分隔。两个顺反应元件(CRE)均为茎环结构，第一个CRE与3’末端的ORF2及非编码区重合；第二个CRE在JR区。其中位于基因组5’端的ORF1编码病毒的非衣壳蛋白，包含一个高变区；位于基因组3’端的ORF2编码病毒的衣壳蛋白，ORF3编码一个小的多功能蛋白。
目前，由于小动物感染模型和有效的细胞培养系统的缺乏导致在HEV复制循环和发病机制上的研究受到了阻碍，导致现在对HEV的复制机制了解甚少。建立支持病毒复制的细胞系对于深入病毒相关细节方面的研究是十分重要的。因此，建立一种能够支持HEV高效复制的细胞系对于HEV的深入研究十分必要[6]。
一般认为，RNA病毒基因组上特异性的包装信号序列一般位于病毒基因组两端的非编码区，而与编码病毒蛋白特别是编码衣壳蛋白的区域无关。因此，通过在培养细胞中提供不表达衣壳蛋白但可自主复制的病毒replicon，以及另外表达衣壳蛋白，作为包装病毒的材料，可以导致replicon RNA被包装进病毒样颗粒，形成反式包装体系[7]。
病毒复制子（eplicon）指的是在病毒感染性克隆全长的基础上，通过人为的缺失病毒的部分或全部结构蛋白基因或由外源性报告基因替代，但保留与病毒复制翻译相关的病毒亚基因组RNA。病毒复制子可以基本模拟野生型病毒的复制过程，帮助研究者研究病毒基因组RNA的复制以及控制机制，同时病毒复制子具有无感染性，不会诱发细胞凋亡等优点。现阶段，病毒复制子系统己成为病毒复制机制研究的重要模型，并被广泛应用于新型疫苗的研发、抗病毒药物筛选之中。
PiggyBac 转座子属于Ⅱ型转座子，最新研究结果显示PiggyBac 介导的转基因效率在细胞水平上可以达到10%；转入的基因不形成串联多聚体，而且基因插入的位点多、特异性强，作为转基因载体能够容纳高达100 kb 的外源基因[8]。同时，基于IRES 构建的双顺反子表达载体[9]和具有自我剪切功能的T2A肽链在很多领域已经成功用于多基因表达研究[10]。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
前言 2
1材料与方法 3
1.1材料 3
1.1.1 质粒、菌株和细胞 质粒 3
1.1.2 工具酶和试剂 3
1.2 载体构建 3
1.2.1 质粒载体PB513，GFP基因的敲除 3
1.2.2 构建含有筛选基因的转基因载体PBHEVORF2112a606a 4
1.2.3 感受态细胞的制备 4
1.2.4 转化 5
1.2.5 pBpuro513ORF2载体的鉴定 5
1.2.6 质粒的提取 5
1.3在Hun 7细胞中表达ORF2蛋白 5
1.3.1细胞的准备 5
1.3.2转染 6
1.4 间接免疫荧光检测目的蛋白的表达及免疫活性 6
1.5 细胞中总RNA的提取及RTPCR扩增 6
1.5.1 用Trizol法提取Huh 7细胞总RNA 6
1.5.2 一步法qRTPCR扩增 6
2 结果与分析 7
2.1质粒的构建 7
2.1.1载体质粒中GFP的敲出 7
2.1.2目的基因ORF2的插入 7
2.2 Huh 7细胞嘌呤霉素最佳筛选浓度的测定 7
2.3 间接免疫荧光检测蛋白的表达 8
2.4 戊型肝炎病 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
毒ORF2 基因表达量变化 8
3 讨论 8
3.1 稳定表达HEV衣壳蛋白的细胞系与疫苗生产 8
3.2 为HEV的反式包装提供了蛋白材料 9
3.3 PB转座子将外源基因插入到细胞基因组染色体 9
致谢 10
参考文献 10
表1 Overlap PCR目的片段引物序列 4
图1 重组表达载体的构建 3
图2 菌落PCR鉴定重组质粒阳性率 7
表2 不同浓度嘌呤霉素对Huh 7细胞生长的影响 7
图3嘌呤霉素筛选第3天时Huh 7 细胞情况 7
图4 pBpuro513ORF2转染Huh 7细 8
图5 实验组和对照组细胞中目的基因的mRNA的表达量 8
表达戊型肝炎病毒（HEV）衣壳蛋白基因ORF2的稳定细胞系的构建
引言
引言 戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)是由前苏联学者Balayan于1983年首次用免疫电镜观察到的病毒颗粒[1]，在1989年被正式命名为HEV。目前在许多发展中国家，HEV引起了急性戊型肝炎的流行，与此同时，HEV也流行于一些发达国家。戊型肝炎是公认的人畜共患病，其传播途径是经粪口途径传播。目前HEV共有1、2、3、4型和禽、鼠、兔HEV，其中1型和2型HEV的主要感染对象是人类，可导致流行性戊型肝炎的发生；3型和4型HEV既可以感染人，也可以感染动物，猪是主要动物宿主[2]。禽和鼠HEV不感染人，兔HEV可跨种系传播[3]。
近年来，研究工作者对从动物体中分离得到的HEV样毒株的研究表明，该病毒有向人畜共患病转移的趋势。HEV是引起戊型肝炎的病原体，而戊型肝炎又是急性肝炎的主要形式，因此，对HEV的研究对于控制急性肝炎的传播具有十分重要的意义。这种疾病流行于亚洲、非洲和拉丁美洲的大部分地区[4]。估计全球有20亿人生活在戊型肝炎流行的地区。所有流行地区的共同特征是当地的饮用水被污染，患者经由口腔途径感染。最高的感染率出现在公共卫生和社会经济地位差的地区，表明若采取有效的公共卫生措施对该病的防控有很大的意义。次要的传播途径是垂直传播和血液传播。但研究表明，人和人通过相接触传播的效率很低[5]。
HEV是一种单链正股的非囊膜RNA病毒。HEV的基因组大小约为7.2 kb，包含3个开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)。HEV基因组中的连接区域(Junction Region, JR)将ORF1与ORF2、ORF3分隔。两个顺反应元件(CRE)均为茎环结构，第一个CRE与3’末端的ORF2及非编码区重合；第二个CRE在JR区。其中位于基因组5’端的ORF1编码病毒的非衣壳蛋白，包含一个高变区；位于基因组3’端的ORF2编码病毒的衣壳蛋白，ORF3编码一个小的多功能蛋白。
目前，由于小动物感染模型和有效的细胞培养系统的缺乏导致在HEV复制循环和发病机制上的研究受到了阻碍，导致现在对HEV的复制机制了解甚少。建立支持病毒复制的细胞系对于深入病毒相关细节方面的研究是十分重要的。因此，建立一种能够支持HEV高效复制的细胞系对于HEV的深入研究十分必要[6]。
一般认为，RNA病毒基因组上特异性的包装信号序列一般位于病毒基因组两端的非编码区，而与编码病毒蛋白特别是编码衣壳蛋白的区域无关。因此，通过在培养细胞中提供不表达衣壳蛋白但可自主复制的病毒replicon，以及另外表达衣壳蛋白，作为包装病毒的材料，可以导致replicon RNA被包装进病毒样颗粒，形成反式包装体系[7]。
病毒复制子（eplicon）指的是在病毒感染性克隆全长的基础上，通过人为的缺失病毒的部分或全部结构蛋白基因或由外源性报告基因替代，但保留与病毒复制翻译相关的病毒亚基因组RNA。病毒复制子可以基本模拟野生型病毒的复制过程，帮助研究者研究病毒基因组RNA的复制以及控制机制，同时病毒复制子具有无感染性，不会诱发细胞凋亡等优点。现阶段，病毒复制子系统己成为病毒复制机制研究的重要模型，并被广泛应用于新型疫苗的研发、抗病毒药物筛选之中。
PiggyBac 转座子属于Ⅱ型转座子，最新研究结果显示PiggyBac 介导的转基因效率在细胞水平上可以达到10%；转入的基因不形成串联多聚体，而且基因插入的位点多、特异性强，作为转基因载体能够容纳高达100 kb 的外源基因[8]。同时，基于IRES 构建的双顺反子表达载体[9]和具有自我剪切功能的T2A肽链在很多领域已经成功用于多基因表达研究[10]。
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