香紫苏二醇生物转化基因的筛选
香紫苏二醇生物转化基因的筛选[20200507184451]
摘要：本实验以课题组前期获得一株转化香紫苏醇合成香紫苏二醇的菌株为研究对象，拟对其进行基因文库的构建和文库的筛选，期望获得香紫苏醇到香紫苏二醇生物转化的完整基因簇，并对基因簇中的各个基因进行表征，为下一步的基因工程改造，提高转化效率打下基础。实验首先优化基本培养基，获得了能够支撑菌株生长的以香紫苏醇为唯一碳源的基本培养基，为后续的文库筛选打下了基础。课题然后开展了Fosmid文库的构建，文库的平均插入片段长度在30 kb以上。利用基本培养基，以香紫苏醇为唯一碳源，筛选文库。通过大量的文库筛选，获得了一个稳定能在香紫苏醇为唯一碳源的基本培养基中生长的转化子，对其进行了活力验证和质粒提取，初步确定获得了转化香紫苏醇到香紫苏二醇的基因。
关键字：香紫苏醇；香紫苏二醇；基本培养基；Fosmid文库；文库筛选
The Screening of Biosynthetic Gene of Sclareol Glycol
Student majoring in Veterinary medicine Zhang Caili
Tutor Lei Zhihai Yu Bo
Abstract：A strain which can transform sclareol to sclareol glycol was obtained by the research group previously. In this experiment I studied the strain as the object and constructed the gene library and screened the librariy, expecting to acquire the complete gene cluster which accomplishs the biotransformation from sclareol to sclareol glycol. I characterized each gene of the gene cluster to lay the foundation for genetic engineering and improving the conversion efficiency. At first the experiment optimized the basal salt medium to gain the basal medium with sclareol as the sole carbon source. The basal salt medium could support the growth of the strain and was used for library screening. Then I carried out the construction of the fosmid library, which was inserted DNA fragment with length more than 30 kb by average. Use the basic medium with sclareol as the sole carbon source to screening the gene librariey and get a stable transformant growing on the medium with sclareol as sole carbon source. Verify the vitality of the transformant and extract the plasmid to get gene transforming sclareol to sclareol glycol.
香紫苏二醇是以香紫苏醇为原料合成珍贵动物香料龙涎香的主要替代物——降龙涎醚过程中重要的中间产物[1]。从香紫苏中提取得到的香紫苏醇具有与香紫苏二醇及降龙涎醚相似的碳原子骨架。化学合成时香紫苏醇经过氧化还原可以得到香紫苏二醇，再经过环化就可得到降龙涎醚[2]。但其中存在各种问题，如回收率低，氧化剂价格过高，污染严重等。生物合成具有反应条件温和、高度的立体选择性、环境友好等优点，已经成为绿色化学研究的重要领域之一。若是从构建的Fosmid基因文库中筛选获得降解香紫苏醇为香紫苏二醇的基因片段，则可以实现降龙涎醚香料的大量工业合成，具有很好的发展和应用前景。
目前生物发酵方法氧化香紫苏醇得到重视，已筛选出菌株可以有效的将香紫苏醇及其衍生物等降解为香紫苏醚、降龙涎醚、香紫苏二醇和龙涎香内酯[3]，例如Wolf-Rainer Abraharn筛选出Bacillus sphaericus ATCC13805可将香紫苏醇转化为香紫苏二醇[4]，Gerard Aranda 等利用灰毛霉菌Mucor Plumbeus ATCC4740实现了香紫苏醇的羟基化[5-6]，Farooq Afgan等研究了一种植物致病真菌灰葡萄孢Botrytics Cinerea对香紫苏醇的羟基化转化[7]。但是已筛选出的高活性菌株并不多。
当前发现新基因并研究其功能已经成为功能基因组研究的热点。功能基因组学研究的基本手段之一便是构建DNA基因组文库[8]，文库中克隆片段包含物种本身所有的遗传信息基因，可真实反映出基因组的全部信息[9]。基因组文库不仅保存物种的遗传信息，而且提供了一个筛选基因的平台，可用于分离鉴定具有特定功能的基因[10]。分离出有应用价值的新基因才可以实现生物工程产业化。Fosmid 载体系统是近年来应用较为广泛的构建大片段文库的新载体，即将pBAC引入PUCcos融合后构建的载体系统，其含有大肠杆菌F因子的黏粒[11]，既具有黏粒载体增殖与包装效率高的优点，又有大肠杆菌F 因子单拷贝、稳定性高、随机性好的特性；同时载体上又有一个可诱导的oriV高拷贝复制起始点，需要时可诱导达到高拷贝(50个左右)，便于下游指纹图谱、末端测序、染色体定位等工作的开展[12]。本文针对实验室筛选出可将香紫苏醇转化为香紫苏二醇的菌株作为目标菌株，构建全基因组文库，进行香紫苏醇到香紫苏二醇生物转化途径中基因的筛选。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验菌株
实验菌株是中国科学院微生物研究所筛选并保藏的可以降解香紫苏醇为香紫苏二醇的菌株。
1.1.2 主要试剂
香紫苏醇购自北京豪尔思科技有限公司，香紫苏二醇购自西安应化生物技术有限公司，乙酸乙酯购自德国CNW公司，酵母提取物、胰蛋白胨购自英国Oxoid公司，诱导液购自美国Epicentre公司，其他试剂均为国产分析纯。BAC/PAC DNA Isolation Kit试剂盒购自美国Omega公司。
1.1.3 培养基
Luria-Bertani培养基（LB）液体配方为：10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，蒸馏水定容至1000 mL。121 ℃高温高压灭菌20 min。
抗性LB培养基的氯霉素终浓度为12.5 μg/mL。
YM液体培养基配方为：3 g酵母提取物，3 g麦芽糖提取物，10 g葡萄糖，5 g胰蛋白胨，蒸馏水定容至1000 mL。pH 6.2。115 ℃高温高压灭菌15 min。
YM固体培养平板为YM液体培养基加入1.5%琼脂。
基本无机盐培养基（BSM）配方为：2.44 g KH2PO4，14.04 g Na2HPO4·12H2O，2 g NH4Cl，0.2 g MgCl2·6H20，0.001 g CaCl2·2H2O，5 mL金属离子混合液，0.2 mL维生素混合液，蒸馏水定容至1000 mL。121 ℃高温高压灭菌20 min。
BSM培养基中金属离子混合液配方为：0.5 g FeCl2·4H2O，0.5 g MnCl2，0.1 g NaMoO4·2H2O，0.05 g CuCl2，120 mM HCl，蒸馏水定容至1000 mL，混匀后室温保存。
BSM培养基中维生素混合液配方为：400 mg D-泛酸钙，200 mg 肌酸，400 mg 尼克酸，400 mg 吡哆胺，0.5 mg 钴胺素，200 mg 对氨基苯甲酸，蒸馏水定容至200 mL。混匀后4℃冰保存。
BSM1培养基配方：BSM基础培养基中添加加10 g 葡萄糖和0.5 g 酵母提取物。
BSM2培养基配方：BSM基础培养基中添加加10 g 葡萄糖。
1.1.4 主要仪器
1）GC1120气相色谱仪购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司。
2）氢空一体机HA-300购自北京中惠普有限公司。
3）UV-5200型紫外可见分光光度计购自上海元析仪器有限公司。
4）MB100-4A 微孔板恒温振荡器购自上海比朗仪器制造有限公司。
5）SPECTRAMAX 190酶标仪购自美国Molecular Devices公司。
6）低温离心机购自美国Sigma公司。
7）恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司
8）恒温摇床分别购自江苏太仓设备厂和哈尔滨东联电器开发有限公司。
9）立式压力蒸汽灭菌器购自上海医疗器械厂。
10）96孔复制器购自广州迈博生物科技有限公司。
11）PB-10标准型电化学分析仪/PH计(酸度计)购自德国赛多利斯集团。
12）Mill-Q纯水机系统购自美国MILLIPORE默克密理博公司
13）超微量分光光度计NanoVue Plus购自美国GE公司。
1.2 实验方法
1.2.1 筛选基本培养基
1.2.1.1 实验菌株活化
将实验菌株自-80℃冰箱中取出。制作YM固体培养基平板，划线培养，置于24℃恒温培养箱中培养48 h。挑取平板上单菌落于100 μL YM液体培养基中，吹吸混悬，再划线转接于YM固体培养基平板，24℃恒温培养48 h，使菌株充分活化。
挑取第二次划线培养的平板上的单菌落，转接于10 mL YM液体培养基中进行富集培养，24℃、180 r/min恒温摇床中培养。菌株生长较为缓慢，每天测定菌液的OD600值，以保证接种时菌株处于对数期。
1.2.1.2 实验菌株培养
取YM液体培养基中对数期后期的菌液以1%的接种量接种于50 mL BSM1培养基中，24℃、180 r/min条件下振荡培养。每天测定菌液的OD600值。
取BSM1液体培养基中对数期后期的菌液以1%的接种量接种于50 ml BSM2培养基中，24℃、180 r/min条件下振荡培养。每天测定菌液的OD600值。
1.2.1.3 基本培养基筛选
用酒精配制1 M 的香紫苏醇溶液。按照表1中方法配制不同浓度的香紫苏醇-BSM培养基，最终加0.8%的吐温-80。取BSM2液体培养基中对数期后期的菌液以1%的接种量接种于50 ml 各不同香紫苏醇浓度的培养基中，24℃、180 r/min条件下振荡培养。每天测定菌液的OD600值。
表1 配制不同浓度培养基所加溶液体积
Table1 The volume of added solution for preparing medium with different concentrations
香紫苏醇终浓度/mM 2 5 10 20 40 60 80 100
BSM体积/mL 49.9 49.75 49.5 49 48 47 46 45
1M香紫苏醇/mL 0.1 0.25 0.5 1 2 3 4 5
培养一星期后，对样品进行处理，采用气相色谱法检测香紫苏二醇。
对香紫苏二醇的检测为气相色谱法。其样品处理为:取出20 mL的样品，8000 rpm离心5 min，取上清用6 M的HC1酸化到pH<2后，加入4 mL的乙酸乙酯，在30℃的摇床中震荡萃取30 min后倒于分液漏斗中静置30 min，流出下层液体，取上清作为样品进行测定。配制10 mM 香紫苏醇和10 mM 香紫苏二醇标准液，气相色谱检测作为对照。
气相色谱仪气相色谱条件：使用甲基硅酮毛细管柱(30 m×0.32 mm)，采用程序升温(140℃恒温2 min，再以10℃/min升温至240℃，保温20 min)。进样器温度240℃，FID检测器温度250℃。
比较不同香紫苏醇浓度下菌株的生长情况和香紫苏二醇生成情况，选择最佳的香紫苏醇浓度，确定筛选培养基配方。
1.2.2 Fosmid文库构建
将总DNA送宝生物工程（大连）有限公司构建Fosmid文库。
1.2.3 文库筛选
1.2.3.1 复制文库
配制LB 抗性培养基，用96孔复制器在96深孔板中每孔加900 μL LB 抗性培养基。使用多道移液枪向深孔板中加100 μL 文库培养液，使96深孔板和96孔文库板的位置一一对应。深孔板密封，放置于微孔板恒温振荡器中，37℃、500 rpm 震荡过夜。
1.2.3.2 筛选培养
配制BSM培养基，用96孔复制器在96深孔板中每孔加900 μL，按照前期筛选出的香紫苏醇-BSM培养基配方向96深孔板中加入合适量香紫苏醇。
向深孔板中加100 μL LB 培养基。使用一次性96孔板封口膜密封深孔板，放置于微孔板恒温振荡器中，37℃、500 rpm 震荡3 d。
按照上述方法转接100 μL BSM培养物于900 μL香紫苏醇-BSM培养基中。密封，37℃、500 rpm 震荡培养6 d 。
培养6 d 后每孔取样100 μL于96孔板中，酶标仪测各孔的OD600值。用未加入菌液的BSM培养基作为空白对照。处理数据，查找是否有OD600值明显大于均值的孔。
其余菌液继续培养6 d 后，再次取样测OD600值，处理数据，查找出OD600值明显大于均值的孔，记录以作后期复筛。
1.2.3.3 文库初筛
鉴于香紫苏醇难溶于水溶液，为避免培养基中香紫苏醇分布不均匀，尝试以下方法配制香紫苏醇-BSM培养基平板并进行涂板培养。按照BSM培养基配方配制BSM液体培养基（灭菌前不加维生素混合液）100 mL，以2 %的比例加入琼脂，121℃、30 min 高压灭菌，50℃培养箱中放置以防培养基凝固。倒板前，向培养基中加入20 μL维生素混合液，并加入0.1 % 扩增诱导液，摇匀。随后边摇边加入1 M 香紫苏醇酒精溶液200 μL,注意摇动三角瓶时不可过猛，轻轻晃动，尽量使得香紫苏醇溶解。倒板后，超净台吹干。吸取酶标仪测量OD600值明显较大的孔中培养物100 μL，滴到平板中央然后用涂布棒涂布均匀。涂布均匀后培养皿密封，37℃培养箱培养，每天观察是否长菌。
1.2.3.4 文库复筛
若是初筛时平板上长出单菌落，则用接菌环挑取单菌落，在同种香紫苏醇-BSM培养基平板上划线培养。密封，37℃培养箱培养，每天观察是否长菌。同时挑取单菌落于LB液体培养基中，37℃震荡培养48 h，最后离心菌体，弃上清，用灭菌生理盐水重悬菌体。10%接种于香紫苏醇-BSM液体培养基中，37℃震荡培养7 d。按照气相检测方法处理样品，气相检测是否有香紫苏二醇生成。
1.2.3.5 提取质粒
使用BAC/PAC DNA Isolation Kit试剂盒提取质粒。用超微量分光光度计测量质粒浓度。根据质粒中插入片段两侧的序列，设计合成引物，通过聚合酶链反应（PCR）克隆插入片段，琼脂糖凝胶电泳检测克隆片段。
PCR体系为：模版2 μL，lataq酶0.5 μL，labuffer 5 μL，DNAr引物2 μL，DNAf引物2 μL，dNTP 10 μL，蒸馏水28.5 μL。PCR程序为：95℃，3 min；95℃，30 s；57℃，30 s；72℃，40 min；72℃，10 min。进行30个循环。
1.2.3.6 基因测序
PCR产物符合要求后测序。将测序得到的碱基序列导入BLAST 程序检索同源序列。
2 结果与分析
2.1 筛选合成培养基
2.1.1 实验菌株活化
通过测量YM液体培养基中实验菌株在波长600 nm处测定菌液的OD600值可知，菌株培养60 h 时菌株在YM液体培养基中基本稳定，OD600值最高可达到40 Abs。证明实验菌株活化成功，达到菌株接种的活力值。
2.1.2 实验菌株培养
取YM液体培养基中培养50 h的菌液（对数期）以1%的接种量接种于BSM1培养基中，实验菌株正常生长，在培养40 h后达到稳定期，最高OD600值达10 Abs。
取BSM1液体培养基中培养30 h 的菌液（对数期）以1%的接种量接种于BSM2培养基中，菌株在培养90 h 时OD600值最高，达3 Abs，随后进入稳定期，证明菌株正常生长。
2.1.3 基本培养基筛选
取BSM2液体培养基中培养60 h 的菌液以1%的接种量接种于不同香紫苏醇终浓度的BSM培养基中。通过测量培养物在波长600 nm处测量OD600值知道菌体在香紫苏醇-BSM培养基中生长缓慢，对数期极长，约120 h 后进入稳定期，最高OD600值只达2 Abs（见图1）。
图1. 目标菌株在香紫苏醇-BSM液体培养基中的生长曲线
Fig.1 The growth curve of experiment strain in sclareol-BSM liquid medium
菌体进入稳定期后，对样品进行处理，采用气相色谱法检测香紫苏二醇，2 mM香紫苏醇终浓度结果如图2所示，其中3.990 min出现的峰为溶剂乙酸乙酯，22.290 min为香紫苏二醇，27.598 min为香紫苏醇。图谱表明目标菌株可以在以香紫苏醇为唯一碳源的合成培养基中生长，并有效利用香紫苏醇转化为香紫苏二醇。
图2.香紫苏二醇气相检测图谱
Fig.2 Spectrum of sclareol glycol through gas chromatography
22.290 min：香紫苏二醇 27.598 min：香紫苏醇
通过上述的实验过程，确认了在YM培养基之外，使用基本培养基添加香紫苏醇为唯一碳源的培养条件可以满足生物转化香紫苏醇的需求，为下一步的文库筛选确定了合适的培养基配方。
根据气相检测结果，鉴于其他浓度香紫苏醇-BSM培养基中香紫苏二醇生成量较2 mM香紫苏醇终浓度低，故确定香紫苏醇终浓度为2 mM较适于目标菌株生长。筛选培养基即香紫苏醇-BSM培养基配方为：0.616g香紫苏醇，2.44 g KH2PO4，14.04 g Na2HPO4·12H2O，2 g NH4Cl，0.2 g MgCl2·6H20，0.001 g CaCl2·2H2O，5 mL金属离子混合液，0.2 mL维生素混合液， 1000 mL蒸馏水。121 ℃ 20 min灭菌。
培养基中金属离子混合液配方为：0.5 g FeCl2·4H2O，0.5 g MnCl2，0.1 g NaMoO4·2H2O，0.05 g CuCl2，120 mM HCl，1000 mL蒸馏水，混匀后室温保存。
培养基中维生素混合液配方为：400 mg D-泛酸钙，200 mg 肌酸，400 mg 尼克酸，400 mg 吡哆胺，0.5 mg 钴胺素，200 mg 对氨基苯甲酸，200 mL 蒸馏水。混匀后4℃冰保存。
2.2 文库构建
2.2.1 菌体培养
LB抗性培养基中培养，37℃振荡培养24 h。
2.2.2 提取基因组DNA
提取基因组，分别进行普通电泳和脉冲电泳（图3），以确定制备的基因组可用。
图3. 基因组DNA的普通电泳图（左）和脉冲电泳图（右）
Fig.3 Figure of normol electrophoresis (left) and PFGE (right)of genomic DNA
M1：λ-HindIII digest（100 ng） M2：Low Range PFG Marker 1：XPF01 ( --基因组DNA )
从电泳结果上分析，此次制备的基因组可用。
2.2.3 构建Fosmid文库
1) 用物理方法将基因组DNA进行片断化。
2) 脉冲电泳，切胶回收38 kbp-48 kbp之间的DNA片断。
3) 对DNA片断进行末端平滑化和磷酸化。
4) 普通电泳和脉冲电泳（图4）确认。
图4. DNA修饰后普通电泳图（左）和脉冲电泳图（右）
Fig.4 Picture of normol electrophoresis (left) and PFGE (right)of DNA after modification
M1：λ-HindIII digest（200 ng） M2：λ-HindIII digest（100 ng）
M3：Low Range PFG Marker M4：DNA MWM XV（100 ng） 1：XPF01回收片断（1ul）
从脉冲电泳结果上分析，回收片断长度在38.5～48.5 Kbp之间。
5) 将回收后的片断连接到pCC1 Fos（EPICENTRE）载体上,4℃过夜。
6) 连接液进行包装，转染。
7) 对文库滴度进行确认。
8) 从平板中随机选取16个白色单菌落进行质粒Not I酶切鉴定（图9）。
图9. 质粒Not I酶切后脉冲电泳图
Fig.9 PFGE Figure of plasmid after Not I digesting
M1：DNA MWM XV （100ng）
从脉冲电泳结果上分析，样品插入片断长度均大于30 Kbp，符合对于文库的要求。
2.2.4 末端测序
对这16个Fosmid DNA进行末端测序，测序结果经BLAST后均为---相关序列，说明文库制备正确。
2.2.5 Fosmid文库甘油菌制作
以每孔约100个克隆的量进行96孔板菌体培养，37℃过夜后甘油保存。
2.3 文库筛选
2.3.1 筛选培养
第二次转接入香紫苏醇-BSM培养基中培养6 d后酶标仪测量，用OD600值的增大代表其生长情况。培养物OD600值增长不明显，说明文库中克隆没有明显生长。
转接入香紫苏醇-BSM培养基中培养12 d后酶标仪测量两个96孔板的OD600值，如表2（板一）、表3（板二）所示。
表2 香紫苏醇-BSM培养基中培养12 d后生长情况（OD600/Abs）（板一）
Table2 Growth condition of clones in sclareol-BSM medium
after culturing 12 d（OD600/Abs）(Template 1)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.08 0.08 0.06 0.08 0.09 0.09 0.11 0.02 0.09 0.1 0.11 0.13
B 0.01 0.09 0.05 0.06 0.07 0.09 0.08 0.08 0.01 0.06 0.08 0.12
C 0.11 0.06 0.06 0.1 0.1 0.06 0.07 0.06 0.06 0.06 0.09 0.1
D 0.09 0.07 0.06 0.07 0.05 0.06 0.08 0.06 0.08 0.07 0.08 0.09
E 0.09 0.07 0.05 0.06 0.06 0.07 0.06 0.05 0.09 0.08 0.06 0.08
F 0.07 0.08 0.05 0.08 0.08 0 0.09 0.08 0.08 0.09 0.07 0.11
G 0 0.08 0.09 0.08 0.09 0.09 0.12 0.09 0.08 0.09 0.08 0.1
H 0.09 0.08 0.07 0.08 0.08 0.1 0.1 0.1 0.11 0.09 0.11 0.09
表3 香紫苏醇-BSM培养基中培养12 d 后生长情况（OD600/Abs）（板一）
Table3 Growth condition of clones in sclareol-BSM medium
after culturing 12 d（OD600/Abs）(Template 2)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.01 0.15 0.14 0.11 0.1 0.22 0.12 0.16 0.18 0.16 0.13 0.13
B 0.01 0.08 0.07 0.11 0.1 0.13 0.11 0.17 0.12 0.1 0.08 0.1
C 0.01 0.22 0.06 0.06 0.13 0.11 0.11 0.1 0.09 0.12 0.09 0.13
D 0.01 0.03 0.05 0.08 0.12 0.13 0.08 0.11 0.08 0.12 0.12 0.13
E 0.01 0.09 0.04 0.1 0.1 0.13 0.1 0.11 0.11 0.05 0.06 0.13
F 0.01 0.1 0.09 0.09 0.13 0.14 0.1 0.05 0.11 0.09 0.09 0.14
G 0.14 0.11 0.08 0.11 0.17 0.13 0.11 0.11 0.06 0.12 0.13 0.17
H 0.01 0.1 0.15 0.13 0.23 0.16 0.19 0.16 0.14 0.14 0.14 0.17
2.3.2 文库初筛
吸取表2中OD600值≥0.1的深孔中培养物100 μL于四种不同的香紫苏醇-BSM培养基平板上涂板培养。培养5 d后一平板上出现菌落，可能是目标菌落。
2.3.3 文库复筛
用接种环挑取初筛中平板上的单菌落于香紫苏醇-BSM培养基平板上划线培养，37℃培养箱中放置5 d后平板上再次出现单菌落。证明所筛菌株可以在以香紫苏醇为唯一碳源的固体培养基上生长，菌株中可能含有将香紫苏醇转化为香紫苏二醇的基因片段。挑取单菌落于香紫苏醇-BSM液体培养基中，37℃、180r/min培养7 d。对样品进行处理，气相检测香紫苏二醇。
2.3.4 提取质粒
按照试剂盒说明书成功对筛选出的菌株提取质粒（67.5 ng/μL），琼脂糖凝胶电泳检测质粒大小约为10 kbp。参考质粒中插入片段两端特异序列合成引物，通过PCR合成大量插入片段。
2.3.5 基因测序
将PCR产物纯化后测序，目前正在进行。
3 讨论
3.1 基本培养基筛选
培养基是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。基本培养基，指仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，选择性培养基是指根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学 、物理 因素的抗性而设计的培养基 。其功能是使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选 效率[15]。
本实验筛选合成培养基作为选择性培养基，来完成后期文库筛选工作。微生物生长繁殖均需要培养基含有碳源、氮源、无机盐、生长因子、水及能源。其中，碳源供给菌体生命活动所需的能量和构成菌体细胞以及代谢产物的基础，有糖类、脂肪、某些有机酸等。本实验主要目的是筛选可以降解香紫苏醇为香紫苏二醇的菌株，故用香紫苏醇为唯一碳源。氮源主要构成菌体细胞物质和代谢产物，即蛋白质、氨基酸等之类的含氮代谢物。可分为有机氮源和无机氮源，本实验中选用无机氮源NH4Cl，方便易得。无机盐对于维持盐溶液平衡非常重要，包括大量元素如P、S、K、Mg、Ca、Na等和微量元素如Cu、Zn、Mn、Mo等。生长因子的功能是构成辅酶的组成分，促进生命活动的进行。如生物素、硫胺素、肌醇等，但需要量是极少的。本实验中的生长因子指B族维生素。前期试验中培养基中未加维生素混合液，菌体没有生长。添加维生素后，菌体开始生长，可见维生素对于目标菌株的生长必不可少。可能因为细胞生长代谢中大多数的酶、辅酶是依靠维生素来形成的。
遵循设计合成培养基的基本原则即目标明确、营养协调、物理化学条件适宜、经济节约，完成以香紫苏醇为唯一碳源的合成培养基配方。
3.2 Fosmid文库
根据插入DNA 片段的大小，宏基因组文库可分为小插入片段文库和大插入片段文库。小插入片段文库有质粒文库（小于10 kbp）和噬菌体文库（2～25 kbp）。大插入片段文库有Cosmid 文库（20～40 kbp）、Fosmid文库（35～45 kbp）和BAC文库（100～300 kbp)［16］。稳定的大片段基因组文库能保证基因簇的完整性，更利于目的基因的结构及功能分析［17］。与Cosmid及BAC等大插入片段文库相比，Fosmid文库具有以下优点［18］：(1)Fosmid载体含有大肠杆菌的F因子，从而保证了单拷贝克隆的高稳定性；(2)Fosmid载体含有高拷贝复制起始位点，诱导后可实现高拷贝表达，有利于后续筛选工作的开展；(3)独特的包装过程使得大小在35～45 kbp外的DNA片段均不能被插入到载体上，从而降低了Fosmid文库的假阳性。基于以上Fosmid载体的各项优势，同时考虑插入片段的大小，本试验中选择构建Fosmid文库来筛选香紫苏二醇生物合成基因。
3.3 文库筛选
基因文库的筛选方法很多，可以根据重组载体的选择性标志作筛选，如抗药性标志筛选、插入失活法筛选、α-互补法等。也可以根据重组载体的结构特征进行分析筛选，如重组质粒的快速提取法、限制性核酸内切酶分析、PCR筛选法。还可以用核酸分子杂交检测法，如菌落印迹原位杂交、斑点印迹杂交、Southern印迹杂交和Northern印迹杂交。最终确定可以通过DNA序列分析。本试验中，香紫苏二醇生物合成基因的筛选是通过产生一定的产物来确定的，培养基中香紫苏醇为唯一碳源，如果重组载体中含有可以将香紫苏醇转化为香紫苏二醇的基因，则此重组载体可以存活并生长，最终通过气相检测可以确定是否生成香紫苏二醇。若重组载体中没有可以将香紫苏醇转化为香紫苏二醇的基因，则此重组载体不可以存活
4 结语
香紫苏二醇是重要的香料物质，目前主要用香紫苏醇通过化学合成手段获得，存在价格高，污染严重的缺陷。生物转化具有环境友好、绿色环保的优势而在工业生产中受到越来越多的重视，但目前的生物转化香紫苏醇到香紫苏二醇的生物过程转化率低，反应时间太长而不能满足实际工业生产需求。目前对香紫苏醇到香紫苏二醇的生物转化过程的遗传基因信息未知，也限制了对其进行基因工程改造。本实验筛选出适合实验菌株生长的以香紫苏醇为唯一碳源的基本培养基用于Fosmid文库的筛选，目前已经获得含有目的基因的质粒，测序工作正在进行。确定可以将香紫苏醇转化为香紫苏二醇的基因序列，进而为用基因工程方法高效大量合成香紫苏二醇打下基础。
致谢
参考文献
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摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言4
1材料与方法5
1.1实验材料 5
1.1.1实验菌株 5
1.1.2主要试剂 5 1.1.3培养基 5
1.1.4主要仪器 5
1.1实验方法 6
1.2.1筛选基本培养基 6
1.2.2 Fosmid文库构建 6
1.2.3文库筛选6
2结果与分析7
2.1筛选基本培养基 7
2.1.1 实验菌株活化7
2.1.2 实验菌株培养7
2.1.3基本培养基筛选8
2.2文库构建 9
2.2.1 菌体培养9
2.2.2 提取基因组DNA9
2.2.3 构建Fosmid文库9
2.2.4 末端测序10
2.2.5 Fosmid文库甘油菌制作10
2.3文库筛选 10
2.2.1 筛选培养10
2.2.1 文库初筛11
2.2.1 文库复筛11
2.2.1 提取质粒11
2.2.1 基因测序11
3 讨论 11
3.1基本培养基筛选11
3.2 Fosmid文库12
3.3 文库筛选12
4 结语 12
致谢12
参考文献12
香紫苏二醇生物转化基因的筛选
引言
摘要：本实验以课题组前期获得一株转化香紫苏醇合成香紫苏二醇的菌株为研究对象，拟对其进行基因文库的构建和文库的筛选，期望获得香紫苏醇到香紫苏二醇生物转化的完整基因簇，并对基因簇中的各个基因进行表征，为下一步的基因工程改造，提高转化效率打下基础。实验首先优化基本培养基，获得了能够支撑菌株生长的以香紫苏醇为唯一碳源的基本培养基，为后续的文库筛选打下了基础。课题然后开展了Fosmid文库的构建，文库的平均插入片段长度在30 kb以上。利用基本培养基，以香紫苏醇为唯一碳源，筛选文库。通过大量的文库筛选，获得了一个稳定能在香紫苏醇为唯一碳源的基本培养基中生长的转化子，对其进行了活力验证和质粒提取，初步确定获得了转化香紫苏醇到香紫苏二醇的基因。
关键字：香紫苏醇；香紫苏二醇；基本培养基；Fosmid文库；文库筛选
The Screening of Biosynthetic Gene of Sclareol Glycol
Student majoring in Veterinary medicine Zhang Caili
Tutor Lei Zhihai Yu Bo
Abstract：A strain which can transform sclareol to sclareol glycol was obtained by the research group previously. In this experiment I studied the strain as the object and constructed the gene library and screened the librariy, expecting to acquire the complete gene cluster which accomplishs the biotransformation from sclareol to sclareol glycol. I characterized each gene of the gene cluster to lay the foundation for genetic engineering and improving the conversion efficiency. At first the experiment optimized the basal salt medium to gain the basal medium with sclareol as the sole carbon source. The basal salt medium could support the growth of the strain and was used for library screening. Then I carried out the construction of the fosmid library, which was inserted DNA fragment with length more than 30 kb by average. Use the basic medium with sclareol as the sole carbon source to screening the gene librariey and get a stable transformant growing on the medium with sclareol as sole carbon source. Verify the vitality of the transformant and extract the plasmid to get gene transforming sclareol to sclareol glycol.
香紫苏二醇是以香紫苏醇为原料合成珍贵动物香料龙涎香的主要替代物——降龙涎醚过程中重要的中间产物[1]。从香紫苏中提取得到的香紫苏醇具有与香紫苏二醇及降龙涎醚相似的碳原子骨架。化学合成时香紫苏醇经过氧化还原可以得到香紫苏二醇，再经过环化就可得到降龙涎醚[2]。但其中存在各种问题，如回收率低，氧化剂价格过高，污染严重等。生物合成具有反应条件温和、高度的立体选择性、环境友好等优点，已经成为绿色化学研究的重要领域之一。若是从构建的Fosmid基因文库中筛选获得降解香紫苏醇为香紫苏二醇的基因片段，则可以实现降龙涎醚香料的大量工业合成，具有很好的发展和应用前景。
目前生物发酵方法氧化香紫苏醇得到重视，已筛选出菌株可以有效的将香紫苏醇及其衍生物等降解为香紫苏醚、降龙涎醚、香紫苏二醇和龙涎香内酯[3]，例如Wolf-Rainer Abraharn筛选出Bacillus sphaericus ATCC13805可将香紫苏醇转化为香紫苏二醇[4]，Gerard Aranda 等利用灰毛霉菌Mucor Plumbeus ATCC4740实现了香紫苏醇的羟基化[5-6]，Farooq Afgan等研究了一种植物致病真菌灰葡萄孢Botrytics Cinerea对香紫苏醇的羟基化转化[7]。但是已筛选出的高活性菌株并不多。
当前发现新基因并研究其功能已经成为功能基因组研究的热点。功能基因组学研究的基本手段之一便是构建DNA基因组文库[8]，文库中克隆片段包含物种本身所有的遗传信息基因，可真实反映出基因组的全部信息[9]。基因组文库不仅保存物种的遗传信息，而且提供了一个筛选基因的平台，可用于分离鉴定具有特定功能的基因[10]。分离出有应用价值的新基因才可以实现生物工程产业化。Fosmid 载体系统是近年来应用较为广泛的构建大片段文库的新载体，即将pBAC引入PUCcos融合后构建的载体系统，其含有大肠杆菌F因子的黏粒[11]，既具有黏粒载体增殖与包装效率高的优点，又有大肠杆菌F 因子单拷贝、稳定性高、随机性好的特性；同时载体上又有一个可诱导的oriV高拷贝复制起始点，需要时可诱导达到高拷贝(50个左右)，便于下游指纹图谱、末端测序、染色体定位等工作的开展[12]。本文针对实验室筛选出可将香紫苏醇转化为香紫苏二醇的菌株作为目标菌株，构建全基因组文库，进行香紫苏醇到香紫苏二醇生物转化途径中基因的筛选。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验菌株
实验菌株是中国科学院微生物研究所筛选并保藏的可以降解香紫苏醇为香紫苏二醇的菌株。
1.1.2 主要试剂
香紫苏醇购自北京豪尔思科技有限公司，香紫苏二醇购自西安应化生物技术有限公司，乙酸乙酯购自德国CNW公司，酵母提取物、胰蛋白胨购自英国Oxoid公司，诱导液购自美国Epicentre公司，其他试剂均为国产分析纯。BAC/PAC DNA Isolation Kit试剂盒购自美国Omega公司。
1.1.3 培养基
Luria-Bertani培养基（LB）液体配方为：10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，蒸馏水定容至1000 mL。121 ℃高温高压灭菌20 min。
抗性LB培养基的氯霉素终浓度为12.5 μg/mL。
YM液体培养基配方为：3 g酵母提取物，3 g麦芽糖提取物，10 g葡萄糖，5 g胰蛋白胨，蒸馏水定容至1000 mL。pH 6.2。115 ℃高温高压灭菌15 min。
YM固体培养平板为YM液体培养基加入1.5%琼脂。
基本无机盐培养基（BSM）配方为：2.44 g KH2PO4，14.04 g Na2HPO4·12H2O，2 g NH4Cl，0.2 g MgCl2·6H20，0.001 g CaCl2·2H2O，5 mL金属离子混合液，0.2 mL维生素混合液，蒸馏水定容至1000 mL。121 ℃高温高压灭菌20 min。
BSM培养基中金属离子混合液配方为：0.5 g FeCl2·4H2O，0.5 g MnCl2，0.1 g NaMoO4·2H2O，0.05 g CuCl2，120 mM HCl，蒸馏水定容至1000 mL，混匀后室温保存。
BSM培养基中维生素混合液配方为：400 mg D-泛酸钙，200 mg 肌酸，400 mg 尼克酸，400 mg 吡哆胺，0.5 mg 钴胺素，200 mg 对氨基苯甲酸，蒸馏水定容至200 mL。混匀后4℃冰保存。
BSM1培养基配方：BSM基础培养基中添加加10 g 葡萄糖和0.5 g 酵母提取物。
BSM2培养基配方：BSM基础培养基中添加加10 g 葡萄糖。
1.1.4 主要仪器
1）GC1120气相色谱仪购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司。
2）氢空一体机HA-300购自北京中惠普有限公司。
3）UV-5200型紫外可见分光光度计购自上海元析仪器有限公司
4）MB100-4A 微孔板恒温振荡器购自上海比朗仪器制造有限公司。
5）SPECTRAMAX 190酶标仪购自美国Molecular Devices公司。
6）低温离心机购自美国Sigma公司。
7）恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司
8）恒温摇床分别购自江苏太仓设备厂和哈尔滨东联电器开发有限公司。
9）立式压力蒸汽灭菌器购自上海医疗器械厂。
10）96孔复制器购自广州迈博生物科技有限公司。
11）PB-10标准型电化学分析仪/PH计(酸度计)购自德国赛多利斯集团。
12）Mill-Q纯水机系统购自美国MILLIPORE默克密理博公司
13）超微量分光光度计NanoVue Plus购自美国GE公司。
1.2 实验方法
1.2.1 筛选基本培养基
1.2.1.1 实验菌株活化
将实验菌株自-80℃冰箱中取出。制作YM固体培养基平板，划线培养，置于24℃恒温培养箱中培养48 h。挑取平板上单菌落于100 μL YM液体培养基中，吹吸混悬，再划线转接于YM固体培养基平板，24℃恒温培养48 h，使菌株充分活化。
挑取第二次划线培养的平板上的单菌落，转接于10 mL YM液体培养基中进行富集培养，24℃、180 r/min恒温摇床中培养。菌株生长较为缓慢，每天测定菌液的OD600值，以保证接种时菌株处于对数期。
1.2.1.2 实验菌株培养
取YM液体培养基中对数期后期的菌液以1%的接种量接种于50 mL BSM1培养基中，24℃、180 r/min条件下振荡培养。每天测定菌液的OD600值。
取BSM1液体培养基中对数期后期的菌液以1%的接种量接种于50 ml BSM2培养基中，24℃、180 r/min条件下振荡培养。每天测定菌液的OD600值。
1.2.1.3 基本培养基筛选
用酒精配制1 M 的香紫苏醇溶液。按照表1中方法配制不同浓度的香紫苏醇-BSM培养基，最终加0.8%的吐温-80。取BSM2液体培养基中对数期后期的菌液以1%的接种量接种于50 ml 各不同香紫苏醇浓度的培养基中，24℃、180 r/min条件下振荡培养。每天测定菌液的OD600值。
表1 配制不同浓度培养基所加溶液体积
Table1 The volume of added solution for preparing medium with different concentrations
香紫苏醇终浓度/mM 2 5 10 20 40 60 80 100
BSM体积/mL 49.9 49.75 49.5 49 48 47 46 45
1M香紫苏醇/mL 0.1 0.25 0.5 1 2 3 4 5
培养一星期后，对样品进行处理，采用气相色谱法检测香紫苏二醇。
对香紫苏二醇的检测为气相色谱法。其样品处理为:取出20 mL的样品，8000 rpm离心5 min，取上清用6 M的HC1酸化到pH<2后，加入4 mL的乙酸乙酯，在30℃的摇床中震荡萃取30 min后倒于分液漏斗中静置30 min，流出下层液体，取上清作为样品进行测定。配制10 mM 香紫苏醇和10 mM 香紫苏二醇标准液，气相色谱检测作为对照。
气相色谱仪气相色谱条件：使用甲基硅酮毛细管柱(30 m×0.32 mm)，采用程序升温(140℃恒温2 min，再以10℃/min升温至240℃，保温20 min)。进样器温度240℃，FID检测器温度250℃。
比较不同香紫苏醇浓度下菌株的生长情况和香紫苏二醇生成情况，选择最佳的香紫苏醇浓度，确定筛选培养基配方。
1.2.2 Fosmid文库构建
将总DNA送宝生物工程（大连）有限公司构建Fosmid文库。
1.2.3 文库筛选
1.2.3.1 复制文库
配制LB 抗性培养基，用96孔复制器在96深孔板中每孔加900 μL LB 抗性培养基。使用多道移液枪向深孔板中加100 μL 文库培养液，使96深孔板和96孔文库板的位置一一对应。深孔板密封，放置于微孔板恒温振荡器中，37℃、500 rpm 震荡过夜。
1.2.3.2 筛选培养
配制BSM培养基，用96孔复制器在96深孔板中每孔加900 μL，按照前期筛选出的香紫苏醇-BSM培养基配方向96深孔板中加入合适量香紫苏醇。
向深孔板中加100 μL LB 培养基。使用一次性96孔板封口膜密封深孔板，放置于微孔板恒温振荡器中，37℃、500 rpm 震荡3 d。
按照上述方法转接100 μL BSM培养物于900 μL香紫苏醇-BSM培养基中。密封，37℃、500 rpm 震荡培养6 d 。
培养6 d 后每孔取样100 μL于96孔板中，酶标仪测各孔的OD600值。用未加入菌液的BSM培养基作为空白对照。处理数据，查找是否有OD600值明显大于均值的孔。
其余菌液继续培养6 d 后，再次取样测OD600值，处理数据，查找出OD600值明显大于均值的孔，记录以作后期复筛。
1.2.3.3 文库初筛
鉴于香紫苏醇难溶于水溶液，为避免培养基中香紫苏醇分布不均匀，尝试以下方法配制香紫苏醇-BSM培养基平板并进行涂板培养。按照BSM培养基配方配制BSM液体培养基（灭菌前不加维生素混合液）100 mL，以2 %的比例加入琼脂，121℃、30 min 高压灭菌，50℃培养箱中放置以防培养基凝固。倒板前，向培养基中加入20 μL维生素混合液，并加入0.1 % 扩增诱导液，摇匀。随后边摇边加入1 M 香紫苏醇酒精溶液200 μL,注意摇动三角瓶时不可过猛，轻轻晃动，尽量使得香紫苏醇溶解。倒板后，超净台吹干。吸取酶标仪测量OD600值明显较大的孔中培养物100 μL，滴到平板中央然后用涂布棒涂布均匀。涂布均匀后培养皿密封，37℃培养箱培养，每天观察是否长菌。
1.2.3.4 文库复筛
若是初筛时平板上长出单菌落，则用接菌环挑取单菌落，在同种香紫苏醇-BSM培养基平板上划线培养。密封，37℃培养箱培养，每天观察是否长菌。同时挑取单菌落于LB液体培养基中，37℃震荡培养48 h，最后离心菌体，弃上清，用灭菌生理盐水重悬菌体。10%接种于香紫苏醇-BSM液体培养基中，37℃震荡培养7 d。按照气相检测方法处理样品，气相检测是否有香紫苏二醇生成。
1.2.3.5 提取质粒
使用BAC/PAC DNA Isolation Kit试剂盒提取质粒。用超微量分光光度计测量质粒浓度。根据质粒中插入片段两侧的序列，设计合成引物，通过聚合酶链反应（PCR）克隆插入片段，琼脂糖凝胶电泳检测克隆片段。
PCR体系为：模版2 μL，lataq酶0.5 μL，labuffer 5 μL，DNAr引物2 μL，DNAf引物2 μL，dNTP 10 μL，蒸馏水28.5 μL。PCR程序为：95℃，3 min；95℃，30 s；57℃，30 s；72℃，40 min；72℃，10 min。进行30个循环。
1.2.3.6 基因测序
PCR产物符合要求后测序。将测序得到的碱基序列导入BLAST 程序检索同源序列。
2 结果与分析
2.1 筛选合成培养基
2.1.1 实验菌株活化
通过测量YM液体培养基中实验菌株在波长600 nm处测定菌液的OD600值可知，菌株培养60 h 时菌株在YM液体培养基中基本稳定，OD600值最高可达到40 Abs。证明实验菌株活化成功，达到菌株接种的活力值。
2.1.2 实验菌株培养
取YM液体培养基中培养50 h的菌液（对数期）以1%的接种量接种于BSM1培养基中，实验菌株正常生长，在培养40 h后达到稳定期，最高OD600值达10 Abs。
取BSM1液体培养基中培养30 h 的菌液（对数期）以1%的接种量接种于BSM2培养基中，菌株在培养90 h 时OD600值最高，达3 Abs，随后进入稳定期，证明菌株正常生长。
2.1.3 基本培养基筛选
取BSM2液体培养基中培养60 h 的菌液以1%的接种量接种于不同香紫苏醇终浓度的BSM培养基中。通过测量培养物在波长600 nm处测量OD600值知道菌体在香紫苏醇-BSM培养基中生长缓慢，对数期极长，约120 h 后进入稳定期，最高OD600值只达2 Abs（见图1）。
图1. 目标菌株在香紫苏醇-BSM液体培养基中的生长曲线
Fig.1 The growth curve of experiment strain in sclareol-BSM liquid medium
菌体进入稳定期后，对样品进行处理，采用气相色谱法检测香紫苏二醇，2 mM香紫苏醇终浓度结果如图2所示，其中3.990 min出现的峰为溶剂乙酸乙酯，22.290 min为香紫苏二醇，27.598 min为香紫苏醇。图谱表明目标菌株可以在以香紫苏醇为唯一碳源的合成培养基中生长，并有效利用香紫苏醇转化为香紫苏二醇。
图2.香紫苏二醇气相检测图谱
Fig.2 Spectrum of sclareol glycol through gas chromatography
22.290 min：香紫苏二醇 27.598 min：香紫苏醇
通过上述的实验过程，确认了在YM培养基之外，使用基本培养基添加香紫苏醇为唯一碳源的培养条件可以满足生物转化香紫苏醇的需求，为下一步的文库筛选确定了合适的培养基配方。
根据气相检测结果，鉴于其他浓度香紫苏醇-BSM培养基中香紫苏二醇生成量较2 mM香紫苏醇终浓度低，故确定香紫苏醇终浓度为2 mM较适于目标菌株生长。筛选培养基即香紫苏醇-BSM培养基配方为：0.616g香紫苏醇，2.44 g KH2PO4，14.04 g Na2HPO4·12H2O，2 g NH4Cl，0.2 g MgCl2·6H20，0.001 g CaCl2·2H2O，5 mL金属离子混合液，0.2 mL维生素混合液， 1000 mL蒸馏水。121 ℃ 20 min灭菌。
培养基中金属离子混合液配方为：0.5 g FeCl2·4H2O，0.5 g MnCl2，0.1 g NaMoO4·2H2O，0.05 g CuCl2，120 mM HCl，1000 mL蒸馏水，混匀后室温保存。
培养基中维生素混合液配方为：400 mg D-泛酸钙，200 mg 肌酸，400 mg 尼克酸，400 mg 吡哆胺，0.5 mg 钴胺素，200 mg 对氨基苯甲酸，200 mL 蒸馏水。混匀后4℃冰保存。
2.2 文库构建
2.2.1 菌体培养
LB抗性培养基中培养，37℃振荡培养24 h。
2.2.2 提取基因组DNA
提取基因组，分别进行普通电泳和脉冲电泳（图3），以确定制备的基因组可用。
图3. 基因组DNA的普通电泳图（左）和脉冲电泳图（右）
Fig.3 Figure of normol electrophoresis (left) and PFGE (right)of genomic DNA
M1：λ-HindIII digest（100 ng） M2：Low Range PFG Marker 1：XPF01 ( --基因组DNA )
从电泳结果上分析，此次制备的基因组可用。
2.2.3 构建Fosmid文库
1) 用物理方法将基因组DNA进行片断化。
2) 脉冲电泳，切胶回收38 kbp-48 kbp之间的DNA片断。
3) 对DNA片断进行末端平滑化和磷酸化。
4) 普通电泳和脉冲电泳（图4）确认。
图4. DNA修饰后普通电泳图（左）和脉冲电泳图（右）
Fig.4 Picture of normol electrophoresis (left) and PFGE (right)of DNA after modification
M1：λ-HindIII digest（200 ng） M2：λ-HindIII digest（100 ng）
M3：Low Range PFG Marker M4：DNA MWM XV（100 ng） 1：XPF01回收片断（1ul）
从脉冲电泳结果上分析，回收片断长度在38.5～48.5 Kbp之间。
5) 将回收后的片断连接到pCC1 Fos（EPICENTRE）载体上,4℃过夜。
6) 连接液进行包装，转染。
7) 对文库滴度进行确认。
8) 从平板中随机选取16个白色单菌落进行质粒Not I酶切鉴定（图9）。
图9. 质粒Not I酶切后脉冲电泳图
Fig.9 PFGE Figure of plasmid after Not I digesting
M1：DNA MWM XV （100ng）
从脉冲电泳结果上分析，样品插入片断长度均大于30 Kbp，符合对于文库的要求。
2.2.4 末端测序
对这16个Fosmid DNA进行末端测序，测序结果经BLAST后均为---相关序列，说明文库制备正确。
2.2.5 Fosmid文库甘油菌制作
以每孔约100个克隆的量进行96孔板菌体培养，37℃过夜后甘油保存。
2.3 文库筛选
2.3.1 筛选培养
第二次转接入香紫苏醇-BSM培养基中培养6 d后酶标仪测量，用OD600值的增大代表其生长情况。培养物OD600值增长不明显，说明文库中克隆没有明显生长。
转接入香紫苏醇-BSM培养基中培养12 d后酶标仪测量两个96孔板的OD600值，如表2（板一）、表3（板二）所示。
表2 香紫苏醇-BSM培养基中培养12 d后生长情况（OD600/Abs）（板一）
Table2 Growth condition of clones in sclareol-BSM medium
after culturing 12 d（OD600/Abs）(Template 1)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.08 0.08 0.06 0.08 0.09 0.09 0.11 0.02 0.09 0.1 0.11 0.13
B 0.01 0.09 0.05 0.06 0.07 0.09 0.08 0.08 0.01 0.06 0.08 0.12
C 0.11 0.06 0.06 0.1 0.1 0.06 0.07 0.06 0.06 0.06 0.09 0.1
D 0.09 0.07 0.06 0.07 0.05 0.06 0.08 0.06 0.08 0.07 0.08 0.09
E 0.09 0.07 0.05 0.06 0.06 0.07 0.06 0.05 0.09 0.08 0.06 0.08
F 0.07 0.08 0.05 0.08 0.08 0 0.09 0.08 0.08 0.09 0.07 0.11
G 0 0.08 0.09 0.08 0.09 0.09 0.12 0.09 0.08 0.09 0.08 0.1
H 0.09 0.08 0.07 0.08 0.08 0.1 0.1 0.1 0.11 0.09 0.11 0.09
表3 香紫苏醇-BSM培养基中培养12 d 后生长情况（OD600/Abs）（板一）
Table3 Growth condition of clones in sclareol-BSM medium
after culturing 12 d（OD600/Abs）(Template 2)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.01 0.15 0.14 0.11 0.1 0.22 0.12 0.16 0.18 0.16 0.13 0.13
B 0.01 0.08 0.07 0.11 0.1 0.13 0.11 0.17 0.12 0.1 0.08 0.1
C 0.01 0.22 0.06 0.06 0.13 0.11 0.11 0.1 0.09 0.12 0.09 0.13
D 0.01 0.03 0.05 0.08 0.12 0.13 0.08 0.11 0.08 0.12 0.12 0.13
E 0.01 0.09 0.04 0.1 0.1 0.13 0.1 0.11 0.11 0.05 0.06 0.13
F 0.01 0.1 0.09 0.09 0.13 0.14 0.1 0.05 0.11 0.09 0.09 0.14
G 0.14 0.11 0.08 0.11 0.17 0.13 0.11 0.11 0.06 0.12 0.13 0.17
H 0.01 0.1 0.15 0.13 0.23 0.16 0.19 0.16 0.14 0.14 0.14 0.17
2.3.2 文库初筛
吸取表2中OD600值≥0.1的深孔中培养物100 μL于四种不同的香紫苏醇-BSM培养基平板上涂板培养。培养5 d后一平板上出现菌落，可能是目标菌落。
2.3.3 文库复筛
用接种环挑取初筛中平板上的单菌落于香紫苏醇-BSM培养基平板上划线培养，37℃培养箱中放置5 d后平板上再次出现单菌落。证明所筛菌株可以在以香紫苏醇为唯一碳源的固体培养基上生长，菌株中可能含有将香紫苏醇转化为香紫苏二醇的基因片段。挑取单菌落于香紫苏醇-BSM液体培养基中，37℃、180r/min培养7 d。对样品进行处理，气相检测香紫苏二醇。
2.3.4 提取质粒
按照试剂盒说明书成功对筛选出的菌株提取质粒（67.5 ng/μL），琼脂糖凝胶电泳检测质粒大小约为10 kbp。参考质粒中插入片段两端特异序列合成引物，通过PCR合成大量插入片段。
2.3.5 基因测序
将PCR产物纯化后测序，目前正在进行。
3 讨论
3.1 基本培养基筛选
培养基是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。基本培养基，指仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，选择性培养基是指根据某种微生物
本实验筛选合成培养基作为选择性培养基，来完成后期文库筛选工作。微生物生长繁殖均需要培养基含有碳源、氮源、无机盐、生长因子、水及能源。其中，碳源供给菌体生命活动所需的能量和构成菌体细胞以及代谢产物的基础，有糖类、脂肪、某些有机酸等。本实验主要目的是筛选可以降解香紫苏醇为香紫苏二醇的菌株，故用香紫苏醇为唯一碳源。氮源主要构成菌体细胞物质和代谢产物，即蛋白质、氨基酸等之类的含氮代谢物。可分为有机氮源和无机氮源，本实验中选用无机氮源NH4Cl，方便易得。无机盐对于维持盐溶液平衡非常重要，包括大量元素如P、S、K、Mg、Ca、Na等和微量元素如Cu、Zn、Mn、Mo等。生长因子的功能是构成辅酶的组成分，促进生命活动的进行。如生物素、硫胺素、肌醇等，但需要量是极少的。本实验中的生长因子指B族维生素。前期试验中培养基中未加维生素混合液，菌体没有生长。添加维生素后，菌体开始生长，可见维生素对于目标菌株的生长必不可少。可能因为细胞生长代谢中大多数的酶、辅酶是依靠维生素来形成的。
遵循设计合成培养基的基本原则即目标明确、营养协调、物理化学条件适宜、经济节约，完成以香紫苏醇为唯一碳源的合成培养基配方。
3.2 Fosmid文库
根据插入DNA 片段的大小，宏基因组文库可分为小插入片段文库和大插入片段文库。小插入片段文库有质粒文库（小于10 kbp）和噬菌体文库（2～25 kbp）。大插入片段文库有Cosmid 文库（20～40 kbp）、Fosmid文库（35～45 kbp）和BAC文库（100～300 kbp)［16］。稳定的大片段基因组文库能保证基因簇的完整性，更利于目的基因的结构及功能分析［17］。与Cosmid及BAC等大插入片段文库相比，Fosmid文库具有以下优点［18］：(1)Fosmid载体含有大肠杆菌的F因子，从而保证了单拷贝克隆的高稳定性；(2)Fosmid载体含有高拷贝复制起始位点，诱导后可实现高拷贝表达，有利于后续筛选工作的开展；(3)独特的包装过程使得大小在35～45 kbp外的DNA片段均不能被插入到载体上，从而降低了Fosmid文库的假阳性。基于以上Fosmid载体的各项优势，同时考虑插入片段的大小，本试验中选择构建Fosmid文库来筛选香紫苏二醇生物合成基因。
3.3 文库筛选
基因文库的筛选方法很多，可以根据重组载体的选择性标志作筛选，如抗药性标志筛选、插入失活法筛选、α-互补法等。也可以根据重组载体的结构特征进行分析筛选，如重组质粒的快速提取法、限制性核酸内切酶分析、PCR筛选法。还可以用核酸分子杂交检测法，如菌落印迹原位杂交、斑点印迹杂交、Southern印迹杂交和Northern印迹杂交。最终确定可以通过DNA序列分析。本试验中，香紫苏二醇生物合成基因的筛选是通过产生一定的产物来确定的，培养基中香紫苏醇为唯一碳源，如果重组载体中含有可以将香紫苏醇转化为香紫苏二醇的基因，则此重组载体可以存活并生长，最终通过气相检测可以确定是否生成香紫苏二醇。若重组载体中没有可以将香紫苏醇转化为香紫苏二醇的基因，则此重组载体不可以存活
4 结语
香紫苏二醇是重要的香料物质，目前主要用香紫苏醇通过化学合成手段获得，存在价格高，污染严重的缺陷。生物转化具有环境友好、绿色环保的优势而在工业生产中受到越来越多的重视，但目前的生物转化香紫苏醇到香紫苏二醇的生物过程转化率低，反应时间太长而不能满足实际工业生产需求。目前对香紫苏醇到香紫苏二醇的生物转化过程的遗传基因信息未知，也限制了对其进行基因工程改造。本实验筛选出适合实验菌株生长的以香紫苏醇为唯一碳源的基本培养基用于Fosmid文库的筛选，目前已经获得含有目的基因的质粒，测序工作正在进行。确定可以将香紫苏醇转化为香紫苏二醇的基因序列，进而为用基因工程方法高效大量合成香紫苏二醇打下基础。
致谢
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摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言4
1材料与方法5
1.1实验材料 5
1.1.1实验菌株 5
1.1.2主要试剂 5 1.1.3培养基 5
1.1.4主要仪器 5
1.1实验方法 6
1.2.1筛选基本培养基 6
1.2.2 Fosmid文库构建 6
1.2.3文库筛选6
2结果与分析7
2.1筛选基本培养基 7
2.1.1 实验菌株活化7
2.1.2 实验菌株培养7
2.1.3基本培养基筛选8
2.2文库构建 9
2.2.1 菌体培养9
2.2.2 提取基因组DNA9
2.2.3 构建Fosmid文库9
2.2.4 末端测序10
2.2.5 Fosmid文库甘油菌制作10
2.3文库筛选 10
2.2.1 筛选培养10
2.2.1 文库初筛11
2.2.1 文库复筛11
2.2.1 提取质粒11
2.2.1 基因测序11
3 讨论 11
3.1基本培养基筛选11
3.2 Fosmid文库12
3.3 文库筛选12
4 结语 12
致谢12
参考文献12
香紫苏二醇生物转化基因的筛选
引言
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