睾丸支持细胞的分离培养及鉴定(附件)
本试验研究山羊睾丸支持细胞的分离与纯化及鉴定方法，以山羊睾丸组织为试验材料，利用联合酶消化法将睾丸组织碎块次第消化，差速贴壁法纯化细胞悬液中的支持细胞并进行体外培养。观察其生长及分化情况，采用RT-PCR和免疫荧光等方法对所培养的支持细胞进行鉴定。结果表明其形态结构特征与支持细胞的形态结构特征一致，RT-PCR能够检测到ABP、AMH、Inhibin、transferrin等特异基因的表达，免疫荧光染色显示所培养的细胞内波形蛋白呈阳性表达。表明采用两步酶消化法和差异贴壁法，可达到分离培养纯化山羊睾丸支持细胞的目的，且纯度较高生长状态良好。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1实验动物 3
1.1.2主要试剂4
1.1.3主要仪器4
1.2支持细胞的分离 4
1.3纯化与培养 5
1.4 RTPCR 5
1.4.1总RNA提取 5
1.4.2 RNA质量检测 5
1.4.3 RNA的反转录6
1.4.4引物设计6
1.4.5 PCR反应6
1.5免疫荧光7
2结果与分析 7
2.1 细胞形态 7
2.2目地基因在睾丸支持细胞中的表达 8
2.2.1RNA纯度 8
2.2.2引物验证8
2.3免疫荧光结果 8
3讨论9
致谢9
参考文献10
山羊睾丸支持细胞的分离培养及鉴定
引言
睾丸支持细胞 (Sertoli cell, SC)是曲精细管的重要组成部分，多年来被认为是生精细胞的支架[12]，其能合成与分泌雄激素结合蛋白(Androgen binding protein, ABP)，为生精细胞提供高浓度的雄激素环境。支持细胞构成血睾屏障，对精子的发生起着营养、支持和保护作用[34]，对睾丸的正常生精，保障种群延续和充分利用优良种公畜的精液具有十分重要的意义 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
。在畜牧业中，通过采集睾丸中最为关键维持微环境的支持细胞作为研究对象，可以为雄性不育的治疗提供新的思路和途径。现如今睾丸支持细胞分离培养技术已经较为成熟，已广泛地应用于研究支持细胞功能、精子的发生机理[5]、淋巴细胞免疫抑制[6]以及移植免疫耐受[7]等多个方面，支持细胞的应用前景逐渐显露。本试验参考了传统支持细胞的培养方法，并对其作了部分改进，简化了试验方法的同时提高了支持细胞的纯度和存活率，为进一步的实验打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 15日龄山羊
1.1.2 主要试剂
DPBS（Gibco）
双抗（Sigma）
PBS（Gibco）
DMEM/F12 培养基（Gibco）
Ⅳ胶原酶（Sigma）
DNaseI（Sigma）
胰蛋白酶（Sigma）
胎牛血清(Gibco，FBS)
明胶（Sigma）
EDTA（北京化工）
甲醇（北京化工）
Triton X100（Sigma）
免疫染色封闭液（Beyotime）
鼠抗波形蛋白抗体（Abcam）
兔抗鼠二抗（Abcam）
异硫氰酸荧光素（Sigma，FITC）
4,6联脒2苯基吲哚（Sigma,DAPI）
PCR管（康宁）
RNA提取试剂盒（天根）
RNA反转录试剂盒（宝生）
1.1.3 主要仪器
净化工作台（SWCJ1D，苏净）
手术器械
离心机（Centrifuge 5417R，德国Eppendorf）
恒温气浴摇床（江苏太仓实验设备厂）
60mm、100mm培养皿（Nunc）
12孔培养皿（Axygen）
CO2培养箱（Thermo，美国）
恒温水浴锅( 江苏金坛市荣华仪器制造有限公司)
倒置显微镜（Nikon，T300, 日本）
紫外分光光度计（Thermo Nanodrop）
微波炉（BL604，中国海尔）
PCR仪（PCR Thermal Cycle，大连宝生）
琼脂糖胶电泳仪（DYCP31CN，北京六一）
琼脂糖水平电泳槽（DYCP32A，北京六一）
自动凝胶成像系统（JS380A，上海培清）
激光共聚焦显微镜（Zeiss LSM 710 META，德国）
1.2 睾丸支持细胞的分离
（1）15日龄山羊处死，无菌条件下取睾丸组织浸于含双抗的DPBS中，2 h内送回实验室。
（2）去除睾丸被膜及血管，在体式显微镜下，挑出曲精细管，用DPBS反复清洗，以去除间质细胞。
（3）将曲精细管剪碎，放入15 mL离心管，加入2 mL胶原酶和2 mL DNaseI酶，37℃恒温震荡消化25 min，直到没有大的组织块，加入含10% FBS培养液，终止反应；
（4）用DPBS洗两次，1500 rpm离心10 min，加入0.25%的胰酶，37℃作用10 min。加入10% FBS的培养液，终止第二步酶消化反应，用DPBS洗两次。
1.3 睾丸支持细胞的纯化与培养
加入培养液重悬细胞，用70目网筛过滤，调整细胞密度铺培养皿。移入 5％CO2 、37℃培养箱中培养4 h后换液，利用差异贴壁法把上层未贴壁的生精细胞移除，纯化细胞，加入新的细胞培养液继续培养。之后每隔2 d更换一次培养液。在倒置显微镜下对分离培养的细胞进行观察。当细胞生长至80%以上汇合时，弃培养液，无菌DPBS冲洗，用0.25%胰蛋白酶与0.02%EDTA消化传代。
1.4 RTPCR鉴定支持细胞
1.4.1 提取支持细胞总RNA 按照RNAprep Pure Cell Kit（天根总RNA提取试剂盒）提取支持细胞总RNA，具体操作步骤如下：
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1实验动物 3
1.1.2主要试剂4
1.1.3主要仪器4
1.2支持细胞的分离 4
1.3纯化与培养 5
1.4 RTPCR 5
1.4.1总RNA提取 5
1.4.2 RNA质量检测 5
1.4.3 RNA的反转录6
1.4.4引物设计6
1.4.5 PCR反应6
1.5免疫荧光7
2结果与分析 7
2.1 细胞形态 7
2.2目地基因在睾丸支持细胞中的表达 8
2.2.1RNA纯度 8
2.2.2引物验证8
2.3免疫荧光结果 8
3讨论9
致谢9
参考文献10
山羊睾丸支持细胞的分离培养及鉴定
引言
睾丸支持细胞 (Sertoli cell, SC)是曲精细管的重要组成部分，多年来被认为是生精细胞的支架[12]，其能合成与分泌雄激素结合蛋白(Androgen binding protein, ABP)，为生精细胞提供高浓度的雄激素环境。支持细胞构成血睾屏障，对精子的发生起着营养、支持和保护作用[34]，对睾丸的正常生精，保障种群延续和充分利用优良种公畜的精液具有十分重要的意义 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
。在畜牧业中，通过采集睾丸中最为关键维持微环境的支持细胞作为研究对象，可以为雄性不育的治疗提供新的思路和途径。现如今睾丸支持细胞分离培养技术已经较为成熟，已广泛地应用于研究支持细胞功能、精子的发生机理[5]、淋巴细胞免疫抑制[6]以及移植免疫耐受[7]等多个方面，支持细胞的应用前景逐渐显露。本试验参考了传统支持细胞的培养方法，并对其作了部分改进，简化了试验方法的同时提高了支持细胞的纯度和存活率，为进一步的实验打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 15日龄山羊
1.1.2 主要试剂
DPBS（Gibco）
双抗（Sigma）
PBS（Gibco）
DMEM/F12 培养基（Gibco）
Ⅳ胶原酶（Sigma）
DNaseI（Sigma）
胰蛋白酶（Sigma）
胎牛血清(Gibco，FBS)
明胶（Sigma）
EDTA（北京化工）
甲醇（北京化工）
Triton X100（Sigma）
免疫染色封闭液（Beyotime）
鼠抗波形蛋白抗体（Abcam）
兔抗鼠二抗（Abcam）
异硫氰酸荧光素（Sigma，FITC）
4,6联脒2苯基吲哚（Sigma,DAPI）
PCR管（康宁）
RNA提取试剂盒（天根）
RNA反转录试剂盒（宝生）
1.1.3 主要仪器
净化工作台（SWCJ1D，苏净）
手术器械
离心机（Centrifuge 5417R，德国Eppendorf）
恒温气浴摇床（江苏太仓实验设备厂）
60mm、100mm培养皿（Nunc）
12孔培养皿（Axygen）
CO2培养箱（Thermo，美国）
恒温水浴锅( 江苏金坛市荣华仪器制造有限公司)
倒置显微镜（Nikon，T300, 日本）
紫外分光光度计（Thermo Nanodrop）
微波炉（BL604，中国海尔）
PCR仪（PCR Thermal Cycle，大连宝生）
琼脂糖胶电泳仪（DYCP31CN，北京六一）
琼脂糖水平电泳槽（DYCP32A，北京六一）
自动凝胶成像系统（JS380A，上海培清）
激光共聚焦显微镜（Zeiss LSM 710 META，德国）
1.2 睾丸支持细胞的分离
（1）15日龄山羊处死，无菌条件下取睾丸组织浸于含双抗的DPBS中，2 h内送回实验室。
（2）去除睾丸被膜及血管，在体式显微镜下，挑出曲精细管，用DPBS反复清洗，以去除间质细胞。
（3）将曲精细管剪碎，放入15 mL离心管，加入2 mL胶原酶和2 mL DNaseI酶，37℃恒温震荡消化25 min，直到没有大的组织块，加入含10% FBS培养液，终止反应；
（4）用DPBS洗两次，1500 rpm离心10 min，加入0.25%的胰酶，37℃作用10 min。加入10% FBS的培养液，终止第二步酶消化反应，用DPBS洗两次。
1.3 睾丸支持细胞的纯化与培养
加入培养液重悬细胞，用70目网筛过滤，调整细胞密度铺培养皿。移入 5％CO2 、37℃培养箱中培养4 h后换液，利用差异贴壁法把上层未贴壁的生精细胞移除，纯化细胞，加入新的细胞培养液继续培养。之后每隔2 d更换一次培养液。在倒置显微镜下对分离培养的细胞进行观察。当细胞生长至80%以上汇合时，弃培养液，无菌DPBS冲洗，用0.25%胰蛋白酶与0.02%EDTA消化传代。
1.4 RTPCR鉴定支持细胞
1.4.1 提取支持细胞总RNA 按照RNAprep Pure Cell Kit（天根总RNA提取试剂盒）提取支持细胞总RNA，具体操作步骤如下：
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