类猪圆环病毒p1的分子流行病学研究
：类猪圆环病毒P1 是新发现的一种病原，能引起仔猪出现类似猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）症状，是目前所知的具有最小基因组的病毒。【目的】检测江苏、浙江等地区猪场的疑似PMWS病猪和部分表观健康猪的样品中的P1病毒，进行分子流行病学分析。【方法】首先利用PCR方法对样品所提取的DNA进行扩增，将P1阳性毒株送检测序，运用DNAStar分析其同源性。【结论】不同地区猪场所检测到的P1基因序列同源性极高，在98.8%以上，地域性差异小。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 P1研究现状1
1.1 P1的发现1
1.2 研究的目的和意义2
2 材料与方法2
2.1材料2
2.1.1 P1组织病料样品2
2.1.2 分子生物学试剂2
2.1.3 主要溶液配方3
2.1.4 主要仪器设备3
2.2 方法3
2.2.1 病料的处理3
2.2.2 DNA模板的制备3
2.2.3 PCR4
2.2.4 序列比较4
3 结果与分析 4
3.1中国类猪圆环病毒因子P1的流行情况4
3.2 测序与鉴定分析5
3.2.1 P1基因核苷酸同源性比较5
3.2.2 P1基因系统进化树6
4 讨论 6
致谢7
参考文献7
类猪圆环病毒P1的分子流行病学研究
引言
猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2, PCV2)是引起猪断奶后多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)和相关疾病的重要病原，已给世界养猪业带来了巨大的经济损失。类猪圆环病毒P1(Porcine Circovirus like Virus P1)是在临床诊断PMWS过程中，从患猪血清中分离到的一株类圆环病毒因子，与PCV2类似，P1是一种无囊膜的
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
单股环状DNA病毒，部分基因组与PCV2 ORF2高度同源。有研究人员推测，类圆环病毒P1因子可能与PCV2或其他病毒混合感染在引起PMWS症状中发挥着一定的作用。因此，通过对P1分子流行病学的研究，为有效预防和控制PMWS等疾病提供一定帮助。
1 P1研究现状
1．1 P1的发现
猪圆环病毒(porcine circovirus, PCV)是一种无囊膜,直径平均为17 nm的DNA病毒。PCV含有独特的、单股共价闭合环状的基因组,长度约1.7 Kb。在分类地位上PCV属于圆环病毒科。目前己确认PCV有两种基因型(genotype)——PCV type 1(PCV1)和PCV type 2(PCV2)。PCV1最早是从猪肾细胞系PK15中分离的，被认为是无致病性，且广泛存在。而PCV2无论在抗原性还是在基因组方面均与PCV1有所不同,被认为是一种首次报道于加拿大的新的猪病——猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的病原。目前，PMWS己成为全球养猪生产中的一种重要疫病。PMWS可发生于健康状况良好的猪场，以5~12周龄的猪发病率较高，临床主要表现为生长迟缓、进行性消瘦、呼吸困难、贫血、黄疽和腹泻等。
在研究PCV2 过程中，首先发现了类猪圆环病毒因子P1和P2，同PCV2一样，它们也具有环状DNA 基因组，全长分别为648，993个核苷酸。P1为目前为止拥有最小基因组的病毒，病毒粒子呈球形、直径约为25nm，无囊膜，含有单股负链环状DNA，全长648个核苷酸，除16个核苷酸外，P1因子与国内猪圆环病毒2型BF毒株的核苷酸同源率为98.42%，推测P1可能为圆环病毒科的新成员。P1基因组虽然较小，病毒粒子直径却大于PCV2的，说明P1也是一种相对“独立”的病毒，有可能是PCV2与其他生物重组而形成的。通过构建P1 的分子克隆，证实了其在体内的感染性，接种猪出现病毒血症，有的出现了体重减轻、皮肤苍白和腹泻等现象，与PMWS相似。
P1有3个开放阅读框：ORF1，12.5 kD（nt 154—496）；ORF2，3.0 kD（nt 68—155）；ORF3，3.9 kD（nt 153—148）。其中P1最大的ORF1 所编码的氨基酸与其它PCV ORF2 所编码的氨基酸总同源率为22.3%—33.5%。P1因子的ORF2和ORF3所编码的氨基酸分别与PCV2的ORF6和ORF10所编码的高度同源。
就全基因组而言，P1与其它PCV2的核苷酸总同源性为32.6%35.5%，与PCV1的为22.9%，与P2的为63.3%。同时，序列分析表明除P1 5端的前16个核苷酸外，从第17个核苷酸起到第648个核苷酸止，与PCV2(AF381175)反向互补序列的107739核苷酸同源性为98.42%，但在对应PCV2的第461位核苷酸A处，P1缺省1个核苷酸。
1．2 研究的目的与意义
猪圆环病毒２型是近年新发现的猪病毒之一，广泛存在于自然界中，对猪有很强的感染力，各种品种、年龄、不同性别的猪均可感染。PCV2主要侵害猪的免疫系统，降低机体的抵抗力和免疫应答反应，导致被感染猪产生免疫抑制和其它病原微生物的继发感染。该病毒与猪群中发生的许多疾病关系密切，这些相关疾病统称为猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）。近些年，在研究PCV2 过程中，我们发现了类猪圆环病毒因子P1，克隆感染猪出现类似PMWS症状，推测P1可能在PMWS的发生中起到一定的作用，许多研究证实要使猪出现典型的PMWS临床症状, 仅靠PCV2是不够的,必须要有其他因素或因子的参与。本研究的目的旨在通过对我国江苏部分地区P1的检测和分子流行病学研究，揭示P1的基因型和变异情况，了解其在PMWS发生中发挥的作用，为今后PMWS等猪圆环病毒相关疾病预防疫苗的研究，诊断技术的建立提供一定的理论依据，同时也为进一步研究P1的分子致病机理奠定基础。
2 材料与方法
2．1 材料
2．1．1 P1组织病料样品
254份组织病料样品于2015年9月12月采集于江苏、安徽、浙江、河北、山东等地区发生疑似PMWS猪群的发病猪或死亡猪只，和部分表观健康猪只，包括心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰脏、脑、髂骨沟淋巴结、血清和粪便。样品于20℃保存。
2．1．2 分子生物学试剂
柱式病毒DNAout试剂盒：北京天恩泽基因科技有限公司
AxyPrep DAN凝胶回收试剂盒：AXGEN
pMD? 19T Vector：TaKaRa
trans5α和BL21感受态细胞：TransGen Biotech
猪瘟抗体与蓝耳抗体：INDEXX
AGAROSE G10琼脂糖凝胶：BIOWEST
2хPCRMIX和超纯水：DSBIO
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 P1研究现状1
1.1 P1的发现1
1.2 研究的目的和意义2
2 材料与方法2
2.1材料2
2.1.1 P1组织病料样品2
2.1.2 分子生物学试剂2
2.1.3 主要溶液配方3
2.1.4 主要仪器设备3
2.2 方法3
2.2.1 病料的处理3
2.2.2 DNA模板的制备3
2.2.3 PCR4
2.2.4 序列比较4
3 结果与分析 4
3.1中国类猪圆环病毒因子P1的流行情况4
3.2 测序与鉴定分析5
3.2.1 P1基因核苷酸同源性比较5
3.2.2 P1基因系统进化树6
4 讨论 6
致谢7
参考文献7
类猪圆环病毒P1的分子流行病学研究
引言
猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2, PCV2)是引起猪断奶后多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)和相关疾病的重要病原，已给世界养猪业带来了巨大的经济损失。类猪圆环病毒P1(Porcine Circovirus like Virus P1)是在临床诊断PMWS过程中，从患猪血清中分离到的一株类圆环病毒因子，与PCV2类似，P1是一种无囊膜的
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
单股环状DNA病毒，部分基因组与PCV2 ORF2高度同源。有研究人员推测，类圆环病毒P1因子可能与PCV2或其他病毒混合感染在引起PMWS症状中发挥着一定的作用。因此，通过对P1分子流行病学的研究，为有效预防和控制PMWS等疾病提供一定帮助。
1 P1研究现状
1．1 P1的发现
猪圆环病毒(porcine circovirus, PCV)是一种无囊膜,直径平均为17 nm的DNA病毒。PCV含有独特的、单股共价闭合环状的基因组,长度约1.7 Kb。在分类地位上PCV属于圆环病毒科。目前己确认PCV有两种基因型(genotype)——PCV type 1(PCV1)和PCV type 2(PCV2)。PCV1最早是从猪肾细胞系PK15中分离的，被认为是无致病性，且广泛存在。而PCV2无论在抗原性还是在基因组方面均与PCV1有所不同,被认为是一种首次报道于加拿大的新的猪病——猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的病原。目前，PMWS己成为全球养猪生产中的一种重要疫病。PMWS可发生于健康状况良好的猪场，以5~12周龄的猪发病率较高，临床主要表现为生长迟缓、进行性消瘦、呼吸困难、贫血、黄疽和腹泻等。
在研究PCV2 过程中，首先发现了类猪圆环病毒因子P1和P2，同PCV2一样，它们也具有环状DNA 基因组，全长分别为648，993个核苷酸。P1为目前为止拥有最小基因组的病毒，病毒粒子呈球形、直径约为25nm，无囊膜，含有单股负链环状DNA，全长648个核苷酸，除16个核苷酸外，P1因子与国内猪圆环病毒2型BF毒株的核苷酸同源率为98.42%，推测P1可能为圆环病毒科的新成员。P1基因组虽然较小，病毒粒子直径却大于PCV2的，说明P1也是一种相对“独立”的病毒，有可能是PCV2与其他生物重组而形成的。通过构建P1 的分子克隆，证实了其在体内的感染性，接种猪出现病毒血症，有的出现了体重减轻、皮肤苍白和腹泻等现象，与PMWS相似。
P1有3个开放阅读框：ORF1，12.5 kD（nt 154—496）；ORF2，3.0 kD（nt 68—155）；ORF3，3.9 kD（nt 153—148）。其中P1最大的ORF1 所编码的氨基酸与其它PCV ORF2 所编码的氨基酸总同源率为22.3%—33.5%。P1因子的ORF2和ORF3所编码的氨基酸分别与PCV2的ORF6和ORF10所编码的高度同源。
就全基因组而言，P1与其它PCV2的核苷酸总同源性为32.6%35.5%，与PCV1的为22.9%，与P2的为63.3%。同时，序列分析表明除P1 5端的前16个核苷酸外，从第17个核苷酸起到第648个核苷酸止，与PCV2(AF381175)反向互补序列的107739核苷酸同源性为98.42%，但在对应PCV2的第461位核苷酸A处，P1缺省1个核苷酸。
1．2 研究的目的与意义
猪圆环病毒２型是近年新发现的猪病毒之一，广泛存在于自然界中，对猪有很强的感染力，各种品种、年龄、不同性别的猪均可感染。PCV2主要侵害猪的免疫系统，降低机体的抵抗力和免疫应答反应，导致被感染猪产生免疫抑制和其它病原微生物的继发感染。该病毒与猪群中发生的许多疾病关系密切，这些相关疾病统称为猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）。近些年，在研究PCV2 过程中，我们发现了类猪圆环病毒因子P1，克隆感染猪出现类似PMWS症状，推测P1可能在PMWS的发生中起到一定的作用，许多研究证实要使猪出现典型的PMWS临床症状, 仅靠PCV2是不够的,必须要有其他因素或因子的参与。本研究的目的旨在通过对我国江苏部分地区P1的检测和分子流行病学研究，揭示P1的基因型和变异情况，了解其在PMWS发生中发挥的作用，为今后PMWS等猪圆环病毒相关疾病预防疫苗的研究，诊断技术的建立提供一定的理论依据，同时也为进一步研究P1的分子致病机理奠定基础。
2 材料与方法
2．1 材料
2．1．1 P1组织病料样品
254份组织病料样品于2015年9月12月采集于江苏、安徽、浙江、河北、山东等地区发生疑似PMWS猪群的发病猪或死亡猪只，和部分表观健康猪只，包括心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰脏、脑、髂骨沟淋巴结、血清和粪便。样品于20℃保存。
2．1．2 分子生物学试剂
柱式病毒DNAout试剂盒：北京天恩泽基因科技有限公司
AxyPrep DAN凝胶回收试剂盒：AXGEN
pMD? 19T Vector：TaKaRa
trans5α和BL21感受态细胞：TransGen Biotech
猪瘟抗体与蓝耳抗体：INDEXX
AGAROSE G10琼脂糖凝胶：BIOWEST
2хPCRMIX和超纯水：DSBIO
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