ROCK调控小鼠胚胎早期发育
ROCK调控小鼠胚胎早期发育[20200510204211]
摘要：ROCK是Rho小GTP酶的一个效应因子，它对于肌动蛋白组装尤为重要并涉及多种细胞功能，包括细胞收缩，细胞迁移，细胞运动性，及肿瘤细胞侵袭。根据这些，我们研究了ROCK在小鼠早期胚胎发育中的表达及作用。在合子阶段通过Y-27632处理抑制ROCK导致胚胎第一次卵裂失败，并且大多数胚胎无法发育到八细胞阶段。在八细胞阶段用Y-27632处理，胚胎无法发生致密化，并且不能发育到囊胚期。此外，荧光染色强度分析表明肌动蛋白在分裂球细胞膜上的表达显著减少。通过抑制ROCK，两个或两个以上的细胞核在一个细胞中，其原因可能是细胞分裂失败。因此，我们的结果说明ROCK对哺乳动物胚胎模型保守的作用并表明在小鼠胚胎早期发育中ROCK肌动蛋白通路可能调控细胞分裂及囊胚形成。
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关键字:胚胎；肌动蛋白；ROCK；囊胚
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言（或绪论）2
1材料与方法3
1.1材料 3
1.2方法 3
1.2.1受精卵获得与培养3 1.2.2Y-27632处理3
1.3共聚焦显微镜3
1.4数据分析4
2结果与分析4
2.1ROCK在小鼠胚胎发育期定位4
2. 2抑制ROCK活性导致早期胚胎发育失败 4
2. 3抑制ROCK活性导致肌动蛋白减少5
3讨论 6
3.1 ROCK参与哺乳动物早期胚胎发育6
3.2 ROCK通过调控肌动蛋白骨架装配影响胚胎早期发育7
致谢8
参考文献8
图 1 ROCK在小鼠胚胎发育期的亚细胞定位4
图2 Y-27632抑制剂在小鼠胚胎早期卵裂及囊胚形成过程的影响5
图3 Y-27632抑制剂在小鼠早期胚胎发育中对肌动蛋白表达的影响6
ROCK 调控小鼠胚胎早期发育
引言
Key words: Embryo ； Actin ；ROCK ；Blastocyst
引言：小鼠胚胎发育是以从受精卵到囊胚各个发育阶段的一系列分裂为特征。受精后，合子经过第一次卵裂进入由母体调控的二细胞期(Yurttas et al. 2010)。在桑椹胚形成后，卵裂球分泌的液体在细胞间隙积聚，最后在胚胎中央形成囊胚腔，最后从透明带中孵化出并植入子宫，胚胎基因组随后开始被激活。在囊胚期，胚胎分为两部分：内细胞团（ICM）及滋养层（TE）。细胞与细胞间的粘着与底极性 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
对于细胞它们分化为两种类型的细胞必不可少(Marikawa and Alarcón 2009)。
肌动蛋白微丝是通过各种各样化学修饰形成的单体聚合链，包括ATP水解，聚合及解聚作用(Yogurtcu et al. 2012)。肌动蛋白微丝对于哺乳动物卵母细胞成熟，受精(Sun and Schatten 2006),及随后的胚胎发育都非常重要(Rawe et al. 2006)。肌动蛋白微丝参与许多卵母细胞动力现象，包括纺锤体迁移，极体排出，皮质颗粒重新分布，和细胞分裂(Schatten and Sun 2011; Sunet al. 2011; Sun and Kim 2013)。
早先研究已经说明肌动蛋白在分裂球的皮质区以及细胞质中均可检测出，尤其在细胞核周围。肌动蛋白在分裂球分裂时的皮质区中部分布密集并对细胞分裂有重要作用(Gumus et al. 2010)。肌动蛋白微丝高度动态结构受信号通路调控促进肌动蛋白装配或使肌动蛋白解聚。一个重要信号通路是ROCK-LIMK1/2-Cofilin-肌动蛋白通路，它负责调节肌动蛋白组装。
Rho相关激酶（简称ROCK）是小GTP酶中Rho亚家族的一个效应因子并且还是AGC激酶家族的一个成员(Amano et al. 2010)。两种Rho相关激酶，ROCK1及ROCK2，同为肌动蛋白相关蛋白并在肌动蛋白构建，调控细胞收缩、运动、形态及细胞分裂(Riento and Ridley 2003;Mueller et al. 2005)和细胞极化(Amano et al. 2010)中起重要作用。ROCK通过对 LIMK1/2的磷酸化作用促进肌动蛋白构建(Maekawa et al. 1999)。最近报道指出，RhoA被发现在小鼠胚胎着床前的八细胞时期通过特异性抑制剂扰乱Rho活性，将破坏细胞分化及分裂。RhoA的这种功能在致密化时的确对小鼠胚胎肌动蛋白骨架活性非常重要，对滋养层的形成，及内细胞团和随后的发育至关重要(Clayton et al. 1999)。
在小鼠卵母细胞中，ROCK已经被证实在通过肌动蛋白通路调控的纺锤体迁移及细胞分裂中非常重要。然而，ROCK在早期小鼠胚胎发育中的作用仍不得而已。基于此，我们利用了特异性抑制剂Y-27632研究ROCK在小鼠早期胚胎发育中的作用。在该抑制剂作用下，胚胎发育失败并且肌动蛋白表达减少，证实ROCK确实通过调控肌动蛋白表达参与小鼠胚胎发育过程。。
1 材料与方法
1．1 抗体及化学试剂
家兔多克隆抗体-ROCK 抗体 来源：Santa Cruz (Santa Cruz, CA)
Phalloidin-TRITC 及 Alexa Fluor 488, 594抗体 来源：Invitrogen (Carlsbad, CA).
Y-27632抑制剂 来源：Calbiochem (Darmstadt, Germany)。
1．2．1 受精卵获得与培养
实验动物的护理与利用根据中国大学动物研究委员会指引完成。小鼠饲养在温度可控暗度适宜的房间内：循环光照，普通饲喂，由中国大学实验动物单位管理。胚泡完整的卵母细胞从6-8周龄ICR小鼠的卵巢中获取。
ICR小鼠（6-8周龄）首先注射孕马血清促性腺激素（PMS *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
G）。48h后，注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）并立即与公鼠同笼饲养。18h后收集合子并培养在KSOM培养基中(KSOM; Chemicon, Billerica, MA,USA)，石蜡油覆盖，保持37℃及5%CO2空气环境。胚胎在不同时期离开培养进行免疫染色。
1．2．2 Y-27632处理
将Y-27632溶于水（5mM）稀释进KSOM培养基(Chemicon, Billerica, MA, USA)保持浓度为100 μM。胚胎在该培养基中培养，在不同时期进行免疫染色并于显微镜下观察。对照组在新鲜的KSOM培养基中培养。
1．3 共聚焦显微镜
ROCK，或肌动蛋白，胚胎单一着色后固定在4%多聚甲醛PBS缓冲液中，室温培养30min后，转移至0.5 % Triton X-100于湿盒中进行20分钟透膜处理。1h后在1 % BSA并添加PBS缓冲液的封闭液中4℃过夜或室温处理4h后用兔抗-ROCK 抗体（1:50），或10 μg/ml Phalloidin-TRITC处理用0.1 % Tween 20 加0.01 % Triton X-100的PBS缓冲液洗过三次室温1h后，胚胎被Alexa Fluor 488 山羊-抗兔IgG标记（(1:100; ROCK找色)。样品被Hoechst 33342着色10min后用缓冲液洗三次。对ROCK和肌动蛋白进行两次染色，胚胎用抗ROCK抗体及Alexa Fluor 488山羊-抗兔IgG着色。然后用Phalloidin-TRITC标记，30min后用含0.1 % Tween 20+ 0.01 % Triton X-100 的缓冲液洗三次，两分钟后用Hoechst 33342 (10 μg/ml PBS)着色10min。样品固定于载玻片上通过激光扫描共焦显微镜进行观察(Zeiss LSM 700 META )。每种试验条件都至少保持30个胚胎进行观察。
摘要：ROCK是Rho小GTP酶的一个效应因子，它对于肌动蛋白组装尤为重要并涉及多种细胞功能，包括细胞收缩，细胞迁移，细胞运动性，及肿瘤细胞侵袭。根据这些，我们研究了ROCK在小鼠早期胚胎发育中的表达及作用。在合子阶段通过Y-27632处理抑制ROCK导致胚胎第一次卵裂失败，并且大多数胚胎无法发育到八细胞阶段。在八细胞阶段用Y-27632处理，胚胎无法发生致密化，并且不能发育到囊胚期。此外，荧光染色强度分析表明肌动蛋白在分裂球细胞膜上的表达显著减少。通过抑制ROCK，两个或两个以上的细胞核在一个细胞中，其原因可能是细胞分裂失败。因此，我们的结果说明ROCK对哺乳动物胚胎模型保守的作用并表明在小鼠胚胎早期发育中ROCK肌动蛋白通路可能调控细胞分裂及囊胚形成。
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关键字:胚胎；肌动蛋白；ROCK；囊胚
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言（或绪论）2
1材料与方法3
1.1材料 3
1.2方法 3
1.2.1受精卵获得与培养3 1.2.2Y-27632处理3
1.3共聚焦显微镜3
1.4数据分析4
2结果与分析4
2.1ROCK在小鼠胚胎发育期定位4
2. 2抑制ROCK活性导致早期胚胎发育失败 4
2. 3抑制ROCK活性导致肌动蛋白减少5
3讨论 6
3.1 ROCK参与哺乳动物早期胚胎发育6
3.2 ROCK通过调控肌动蛋白骨架装配影响胚胎早期发育7
致谢8
参考文献8
图 1 ROCK在小鼠胚胎发育期的亚细胞定位4
图2 Y-27632抑制剂在小鼠胚胎早期卵裂及囊胚形成过程的影响5
图3 Y-27632抑制剂在小鼠早期胚胎发育中对肌动蛋白表达的影响6
ROCK 调控小鼠胚胎早期发育
引言
Key words: Embryo ； Actin ；ROCK ；Blastocyst
引言：小鼠胚胎发育是以从受精卵到囊胚各个发育阶段的一系列分裂为特征。受精后，合子经过第一次卵裂进入由母体调控的二细胞期(Yurttas et al. 2010)。在桑椹胚形成后，卵裂球分泌的液体在细胞间隙积聚，最后在胚胎中央形成囊胚腔，最后从透明带中孵化出并植入子宫，胚胎基因组随后开始被激活。在囊胚期，胚胎分为两部分：内细胞团（ICM）及滋养层（TE）。细胞与细胞间的粘着与底极性 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
对于细胞它们分化为两种类型的细胞必不可少(Marikawa and Alarcón 2009)。
肌动蛋白微丝是通过各种各样化学修饰形成的单体聚合链，包括ATP水解，聚合及解聚作用(Yogurtcu et al. 2012)。肌动蛋白微丝对于哺乳动物卵母细胞成熟，受精(Sun and Schatten 2006),及随后的胚胎发育都非常重要(Rawe et al. 2006)。肌动蛋白微丝参与许多卵母细胞动力现象，包括纺锤体迁移，极体排出，皮质颗粒重新分布，和细胞分裂(Schatten and Sun 2011; Sunet al. 2011; Sun and Kim 2013)。
早先研究已经说明肌动蛋白在分裂球的皮质区以及细胞质中均可检测出，尤其在细胞核周围。肌动蛋白在分裂球分裂时的皮质区中部分布密集并对细胞分裂有重要作用(Gumus et al. 2010)。肌动蛋白微丝高度动态结构受信号通路调控促进肌动蛋白装配或使肌动蛋白解聚。一个重要信号通路是ROCK-LIMK1/2-Cofilin-肌动蛋白通路，它负责调节肌动蛋白组装。
Rho相关激酶（简称ROCK）是小GTP酶中Rho亚家族的一个效应因子并且还是AGC激酶家族的一个成员(Amano et al. 2010)。两种Rho相关激酶，ROCK1及ROCK2，同为肌动蛋白相关蛋白并在肌动蛋白构建，调控细胞收缩、运动、形态及细胞分裂(Riento and Ridley 2003;Mueller et al. 2005)和细胞极化(Amano et al. 2010)中起重要作用。ROCK通过对 LIMK1/2的磷酸化作用促进肌动蛋白构建(Maekawa et al. 1999)。最近报道指出，RhoA被发现在小鼠胚胎着床前的八细胞时期通过特异性抑制剂扰乱Rho活性，将破坏细胞分化及分裂。RhoA的这种功能在致密化时的确对小鼠胚胎肌动蛋白骨架活性非常重要，对滋养层的形成，及内细胞团和随后的发育至关重要(Clayton et al. 1999)。
在小鼠卵母细胞中，ROCK已经被证实在通过肌动蛋白通路调控的纺锤体迁移及细胞分裂中非常重要。然而，ROCK在早期小鼠胚胎发育中的作用仍不得而已。基于此，我们利用了特异性抑制剂Y-27632研究ROCK在小鼠早期胚胎发育中的作用。在该抑制剂作用下，胚胎发育失败并且肌动蛋白表达减少，证实ROCK确实通过调控肌动蛋白表达参与小鼠胚胎发育过程。。
1 材料与方法
1．1 抗体及化学试剂
家兔多克隆抗体-ROCK 抗体 来源：Santa Cruz (Santa Cruz, CA)
Phalloidin-TRITC 及 Alexa Fluor 488, 594抗体 来源：Invitrogen (Carlsbad, CA).
Y-27632抑制剂 来源：Calbiochem (Darmstadt, Germany)。
1．2．1 受精卵获得与培养
实验动物的护理与利用根据中国大学动物研究委员会指引完成。小鼠饲养在温度可控暗度适宜的房间内：循环光照，普通饲喂，由中国大学实验动物单位管理。胚泡完整的卵母细胞从6-8周龄ICR小鼠的卵巢中获取。
ICR小鼠（6-8周龄）首先注射孕马血清促性腺激素（PMS *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
G）。48h后，注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）并立即与公鼠同笼饲养。18h后收集合子并培养在KSOM培养基中(KSOM; Chemicon, Billerica, MA,USA)，石蜡油覆盖，保持37℃及5%CO2空气环境。胚胎在不同时期离开培养进行免疫染色。
1．2．2 Y-27632处理
将Y-27632溶于水（5mM）稀释进KSOM培养基(Chemicon, Billerica, MA, USA)保持浓度为100 μM。胚胎在该培养基中培养，在不同时期进行免疫染色并于显微镜下观察。对照组在新鲜的KSOM培养基中培养。
1．3 共聚焦显微镜
ROCK，或肌动蛋白，胚胎单一着色后固定在4%多聚甲醛PBS缓冲液中，室温培养30min后，转移至0.5 % Triton X-100于湿盒中进行20分钟透膜处理。1h后在1 % BSA并添加PBS缓冲液的封闭液中4℃过夜或室温处理4h后用兔抗-ROCK 抗体（1:50），或10 μg/ml Phalloidin-TRITC处理用0.1 % Tween 20 加0.01 % Triton X-100的PBS缓冲液洗过三次室温1h后，胚胎被Alexa Fluor 488 山羊-抗兔IgG标记（(1:100; ROCK找色)。样品被Hoechst 33342着色10min后用缓冲液洗三次。对ROCK和肌动蛋白进行两次染色，胚胎用抗ROCK抗体及Alexa Fluor 488山羊-抗兔IgG着色。然后用Phalloidin-TRITC标记，30min后用含0.1 % Tween 20+ 0.01 % Triton X-100 的缓冲液洗三次，两分钟后用Hoechst 33342 (10 μg/ml PBS)着色10min。样品固定于载玻片上通过激光扫描共焦显微镜进行观察(Zeiss LSM 700 META )。每种试验条件都至少保持30个胚胎进行观察。
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