钙离子受体介导色氨酸影响猪十二指肠胃肠激素分泌的机制研究
为探究钙离子受体（CaSR）介导色氨酸(Tryptophan)影响猪十二指肠胃肠激素分泌的机制，采用表面灌流系统，研究色氨酸对猪十二指肠胃肠激素分泌的影响，及这种影响是否由CaSR介导。结果表明随着色氨酸浓度的升高，CaSR及胃肠激素（CCK、GIP、PYY）的基因表达量显著升高（P ＜ 0.05），胃肠激素分泌显著增加（P ＜ 0.05）；Ca2+能够使Trp引起的CaSR和胃肠激素基因表达显著提升，胃肠激素的分泌显著增加（P ＜ 0.05）；当CaSR被抑制时，CaSR和胃肠激素基因的表达及胃肠激素的分泌均显著下降（P ＜ 0.05）。说明，色氨酸可以促进胃肠激素的分泌，并且这种作用是由CaSR介导。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1表面灌流系统 2
1.2试剂和仪器 2
1.3试验设计2
1.4测定方法3
1.4.1酶联免疫吸附法3
1.4.2总RNA提取及Realtime PCR3
1.5数据分析3
2结果与分析4
2.1不同浓度LTrp对猪十二指肠CaSR及胃肠激素基因表达及胃肠激素分泌的影响4
2.2 CaSR抑制剂（NPS2143）对LTrp引起的猪十二指肠CaSR及胃肠激素基因表达及分泌的影响5
2.2 Ca2+对Trp调控的CaSR和胃肠激素基因表达及分泌的影响 6
3讨论7
致谢7
参考文献78
钙离子受体介导色氨酸影响猪十二指肠胃肠激素分泌的机制研究
引言
色氨酸属于L型芳香族氨基酸，是单胃动物和幼龄反刍动物的必需氨基酸。研究证明，色氨酸具有调控动物采食量的作用[1]。近年来，人们发现色氨酸还是钙离子受体的激动剂[2]。
动物体内游离的Ca2+作为体内一种普遍存在的信号分子, 可协同蛋白质、酶调节细胞活动，目前研究认为细胞外Ca2+具有第一信使的作用[34]。1993年Brown等[5]从牛的甲状旁腺中首次成功克隆钙 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
离子受体，钙离子受体属于G蛋白偶联受体C家族，它能够将细胞外的信号刺激转化为细胞内的信号，并激活下游通路，调节食物的摄取和消化。钙离子受体广泛分布于甲状旁腺，肾，骨，胃肠系统。后来的研究发现，CaSR在人体多种与钙磷代谢相关的器官组织中均有表达。进一步的研究表明，除了Ca2+，氨基酸（特别是L型芳香族氨基酸）也是CaSR的激动剂配体[6]。但氨基酸激活该受体需要细胞外钙离子的参与[7]。CaSR具有G蛋白偶联受体C家族典型结构，能够感应L氨基酸[8]，调控胆囊收缩素（cholecystokinin，CCK）、胰高血糖素样肽1（Glucagonlike peptide 1 ，GLP1）、酪酪肽（peptide YY，PYY）、葡萄糖促胰岛素肽（gastric inhibitory peptide，GIP）的分泌，因此，研究CaSR介导机制对于探究胃肠道激素基因表达及分泌很重要[9]。但关于CaSR的研究和应用目前大多集中在人和小鼠身上，在猪及其他家畜胃肠道中CaSR的研究目前较少。
为此，本实验旨在研究CaSR介导LTrp对猪十二指肠胃肠激素分泌的影响效应及特征关系，为进一步研究色氨酸调控猪小肠胃肠激素分泌作用机理提供参考依据。
1 材料与方法
1．1 表面灌流系统
参照谈寅飞[10]等，我们建立的表面灌流系统由灌流小室(2.5mL一次性注射器改装而成，实体积1.5mL，图1)、蠕动泵、氧气源(由氧气瓶供气)、储液瓶及导管(硅胶管)、收集管和恒温水浴器组成。（图2）
1．2 试剂和仪器
L色氨酸（L Tryptophan）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自SigmaAldrich（中国，上海）；猪CCK（FUZ044；CCK8 antibody，orb10260，biorbyt）、GLP1（FUZ189；GLP1 antibody, orb10719 biorbyt）、PYY（FUZ240；PYY antibody，LSC191185400，LifeSpan BioSciences）及GIP（FUA192；GIP antibody，GTX37687，GeneTex）ELISA试剂盒购自北京方程佰金科技有限公司（中国，北京）；NPS 2143购自MedChem Express（中国，上海）；Kreb’s培养液（其组分见下表）：
NaCl
HEPES
KCl
CaCl2
MgCl26H2O
Glucose
dH2O
8.00g
6.00g
0.30g
0.20g
0.20g
7.00g
1000.00mL
pH计；酶标仪（Thermo，USA）；SteponePlus? RealTime PCR System（Life Technologies，USA）；超微量分光光度计（Thermo，USA）；低温高速离心机（Eppendorf，Germany）
1. 3 试验设计
将猪颈静脉放血处死，剖开腹腔，剪取十二指肠近端约4 cm，迅速漂洗十二指肠黏膜，将洗净的十二指肠近端剪成约1 mm 2小块，称重，组织块随机分成若干组装入灌流小室，每室400 mg。培养液（不含Trp的Kreb’s液，通入含5% CO2的O2）以6 mL/h的速度预灌流。40 min后，以刺激液灌流，从刺激前40 min起，每20 min收集一管，连续收集160 min。灌流结束后，将收集的灌流液和十二指肠组织块分别保存在20℃和液氮中，待测。
试验以Kreb’s 培养液为基础溶液，分别设置空白对照组和Trp组（分别加入0、20 mM、50 mM Trp）。采用表面灌流系统对猪十二指肠近端组织进行灌流。在Trp组灌流的0min开始收集各组灌流液，每20 min收集一次，连续收集160 min。结束后，测定灌流液中胃肠激素，提取十二指肠组织的RNA并进行Realtime PCR，检测CaSR和胃肠激素基因表达。
将基础液分别加入DMSO(对照)、20 mM Trp、20 mM Trp+NPS2143（CaSR抑制剂），采用表面灌流系统对猪十二指肠近端组织进行灌流。同样在刺激液灌流的0 min开始收集各组灌流液，每20 min收集一次，连续收集160 min。结束后，检测灌流液胃肠激素水平，收集十二指肠组织，用于RNA提取和Realtime PCR分析。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1表面灌流系统 2
1.2试剂和仪器 2
1.3试验设计2
1.4测定方法3
1.4.1酶联免疫吸附法3
1.4.2总RNA提取及Realtime PCR3
1.5数据分析3
2结果与分析4
2.1不同浓度LTrp对猪十二指肠CaSR及胃肠激素基因表达及胃肠激素分泌的影响4
2.2 CaSR抑制剂（NPS2143）对LTrp引起的猪十二指肠CaSR及胃肠激素基因表达及分泌的影响5
2.2 Ca2+对Trp调控的CaSR和胃肠激素基因表达及分泌的影响 6
3讨论7
致谢7
参考文献78
钙离子受体介导色氨酸影响猪十二指肠胃肠激素分泌的机制研究
引言
色氨酸属于L型芳香族氨基酸，是单胃动物和幼龄反刍动物的必需氨基酸。研究证明，色氨酸具有调控动物采食量的作用[1]。近年来，人们发现色氨酸还是钙离子受体的激动剂[2]。
动物体内游离的Ca2+作为体内一种普遍存在的信号分子, 可协同蛋白质、酶调节细胞活动，目前研究认为细胞外Ca2+具有第一信使的作用[34]。1993年Brown等[5]从牛的甲状旁腺中首次成功克隆钙 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
离子受体，钙离子受体属于G蛋白偶联受体C家族，它能够将细胞外的信号刺激转化为细胞内的信号，并激活下游通路，调节食物的摄取和消化。钙离子受体广泛分布于甲状旁腺，肾，骨，胃肠系统。后来的研究发现，CaSR在人体多种与钙磷代谢相关的器官组织中均有表达。进一步的研究表明，除了Ca2+，氨基酸（特别是L型芳香族氨基酸）也是CaSR的激动剂配体[6]。但氨基酸激活该受体需要细胞外钙离子的参与[7]。CaSR具有G蛋白偶联受体C家族典型结构，能够感应L氨基酸[8]，调控胆囊收缩素（cholecystokinin，CCK）、胰高血糖素样肽1（Glucagonlike peptide 1 ，GLP1）、酪酪肽（peptide YY，PYY）、葡萄糖促胰岛素肽（gastric inhibitory peptide，GIP）的分泌，因此，研究CaSR介导机制对于探究胃肠道激素基因表达及分泌很重要[9]。但关于CaSR的研究和应用目前大多集中在人和小鼠身上，在猪及其他家畜胃肠道中CaSR的研究目前较少。
为此，本实验旨在研究CaSR介导LTrp对猪十二指肠胃肠激素分泌的影响效应及特征关系，为进一步研究色氨酸调控猪小肠胃肠激素分泌作用机理提供参考依据。
1 材料与方法
1．1 表面灌流系统
参照谈寅飞[10]等，我们建立的表面灌流系统由灌流小室(2.5mL一次性注射器改装而成，实体积1.5mL，图1)、蠕动泵、氧气源(由氧气瓶供气)、储液瓶及导管(硅胶管)、收集管和恒温水浴器组成。（图2）
1．2 试剂和仪器
L色氨酸（L Tryptophan）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自SigmaAldrich（中国，上海）；猪CCK（FUZ044；CCK8 antibody，orb10260，biorbyt）、GLP1（FUZ189；GLP1 antibody, orb10719 biorbyt）、PYY（FUZ240；PYY antibody，LSC191185400，LifeSpan BioSciences）及GIP（FUA192；GIP antibody，GTX37687，GeneTex）ELISA试剂盒购自北京方程佰金科技有限公司（中国，北京）；NPS 2143购自MedChem Express（中国，上海）；Kreb’s培养液（其组分见下表）：
NaCl
HEPES
KCl
CaCl2
MgCl26H2O
Glucose
dH2O
8.00g
6.00g
0.30g
0.20g
0.20g
7.00g
1000.00mL
pH计；酶标仪（Thermo，USA）；SteponePlus? RealTime PCR System（Life Technologies，USA）；超微量分光光度计（Thermo，USA）；低温高速离心机（Eppendorf，Germany）
1. 3 试验设计
将猪颈静脉放血处死，剖开腹腔，剪取十二指肠近端约4 cm，迅速漂洗十二指肠黏膜，将洗净的十二指肠近端剪成约1 mm 2小块，称重，组织块随机分成若干组装入灌流小室，每室400 mg。培养液（不含Trp的Kreb’s液，通入含5% CO2的O2）以6 mL/h的速度预灌流。40 min后，以刺激液灌流，从刺激前40 min起，每20 min收集一管，连续收集160 min。灌流结束后，将收集的灌流液和十二指肠组织块分别保存在20℃和液氮中，待测。
试验以Kreb’s 培养液为基础溶液，分别设置空白对照组和Trp组（分别加入0、20 mM、50 mM Trp）。采用表面灌流系统对猪十二指肠近端组织进行灌流。在Trp组灌流的0min开始收集各组灌流液，每20 min收集一次，连续收集160 min。结束后，测定灌流液中胃肠激素，提取十二指肠组织的RNA并进行Realtime PCR，检测CaSR和胃肠激素基因表达。
将基础液分别加入DMSO(对照)、20 mM Trp、20 mM Trp+NPS2143（CaSR抑制剂），采用表面灌流系统对猪十二指肠近端组织进行灌流。同样在刺激液灌流的0 min开始收集各组灌流液，每20 min收集一次，连续收集160 min。结束后，检测灌流液胃肠激素水平，收集十二指肠组织，用于RNA提取和Realtime PCR分析。
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