大肠杆菌o157∶h7遗传标志性基因z3276荧光定量pcr方法的建立与应用

大肠杆菌O157∶H7属于大肠杆菌的一种特殊的血清型，这种血清又叫“肠出血性大肠杆菌”，是动物源性传染病，临床宿主主要是牛。为了构建出能够定量检测出大肠杆菌O157∶H7的遗传标志性基因Z3276的荧光定量PCR检测方法，首先设计出特异性的引物，再用PCR扩增Z3276基因片断，然后克隆至载体pMD19-T，转化到DH5α细胞，最后提取阳性重组质粒。将提取后的重组质粒作为整个方案的标准模板，建立一种特异性检测Z3276基因的定量PCR方法，方法经特异性、重复性、敏感性等方面的验证，验证后对临床上采集的样品进行定量PCR检测。检测结果显示，PCR所扩增片段的大小为112bp，100％与GenBank中已知基因序列同源，建立的定量PCR方法中标准品模板在102 -108拷贝/μL范围内Ct值呈现出良好的线性关系，扩增曲线都呈标准的“S”形，标曲的相关系数R2为0.998，扩增效率为109%。整个检测方案的菌液灵敏度可达到200拷贝/μL，说明敏感性较高，与其他易混淆菌株核酸间无交叉反应，体现了较好的特异性，组内与组间的重复性变异系数均小于1.5％，表明方法的重复性合格。使用构建的检测方法对临床样品进行荧光定量PCR检测，阳性检出率与普通PCR比较明显更高。总体而言，本次实验建立的定量检测方法的特异性和重复性较好，敏感性较高，能够快速鉴定大肠杆菌O157∶H7，具有很大的应用前景。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1菌株2
1.2主要试剂和仪器设备2
1.3引物的设计及合成2
1.4 PCR扩增和标准品的制备3
1.5实时荧光定量PCR条件的优化3
1.6标准曲线的绘制3
1.7特异性实验3
1.8重复性验证3
1.9敏感性检测3
1.9.1质粒检测3
1.9.2细菌复苏与计数3
1.9.3纯菌液模板制备3
1.10临床采集样品的检测3
2 结果与分析4
2.1标准品的制备 4
2.2定量PCR *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072* 
扩增最佳条件4
2.3标准曲线的建立4
2.4特异性分析5
2.5重复性验证5
2.6敏感性检测6
2.7临床样品的检测6
3 讨论6
致谢7
参考文献7大肠杆菌O157∶H7遗传标志性基因Z3276荧光定量PCR
方法的建立与应用

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