猪伪狂犬病毒gd基因的原核表达和蛋白纯化
伪狂犬病是由伪狂犬病病毒引起的急性传染病，以发热、奇痒和脑脊髓炎等神经症状为特征，疫源动物和主要贮存宿主以猪为主。本试验参照已发表的 PRV gD基因序列，利用生物软件设计出一对gD基因引物，利用PCR技术扩增伪狂犬病毒的gD 蛋白基因。扩增产物先与 pGEM-T载体连接，获得pGEM-T/gD载体。再将载体上的目的片段克隆，从而获得pET-32a/gD高效表达载体。将pET-32a/gD转化至感受态细胞，经IPTG诱导表达获得重组蛋白。通过SDS-PAGE 电泳检测重组蛋白的可溶性，以尿素纯化包涵体的蛋白纯化方法，获得目的蛋白。gD蛋白的纯化，为后续猪场建立 PRV 检测方法做好前期准备。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.1.1病料、菌株及载体2
1.1.2主要仪器2
1.1.3主要试剂2
1.1.4主要试剂溶液的配制2
1.2实验方法 3
1.2.1 PRV gB 基因的扩增3
1.2.1.1引物设计及合成3
1.2.1.2病料中 DNA 的提取3
1.2.1.3目的基因的扩增3
1.2.2 重组质粒 pGEMT/gD的构建3
1.2.2.1目的片段与 T 载体连接3
1.2.2.2连接产物的转化4
1.2.2.3重组质粒pGEMT/gD 的小量制备4
1.2.2.4重组质粒 pGEMT/gD 的鉴定4
1.2.3 重组质粒 pET32a/gD 的构建4
1.2.3.1载体 pET32a 的酶切回收4
1.2.3.2目的片段的回收5
1.2.3.3目的片段与表达载体片段连接5
1.2.3.4连接产物的转化5
1.2.3.5重组质粒 pET32a/gD 的小量制备5
1.2.3.6重组质粒 pET32a/gD 的双酶切鉴定5
1.2.4 重组质粒的表达与纯化5
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
1.2.4.1重组质粒的小量诱导表达5
1.2.4.2重组蛋白 SDAPAGE 电泳鉴定6
1.2.4.3重组蛋白的大量表达6
1.2.4.4重组蛋白的可溶性检测6
1.2.4.5重组蛋白的纯化6
2结果分析6
2.1目的基因片段的 PCR 扩增6
2.2目的基因的克隆与鉴定7
2.3重组质粒 pET32a/gD 的构建与鉴定7
2.4重组蛋白的鉴定8
2.5重组蛋白表达形式的鉴定8
2.6重组蛋白的纯化9
3讨论 9
致谢10
参考文献10
猪伪狂犬病毒gD基因的原核表达及蛋白纯化
引言
伪狂犬病( Pseudorabies，PR) 是由伪狂犬病病毒 ( Pseudorabies virus，PRV) 引起的具有神经症状的一种急性传染病[1] 。该病以脑脊髓炎和发热为主要特征，常引起妊娠母猪流产、产木乃伊胎等繁殖功能障碍，新生仔猪死亡率较高并伴随有神经症状，衰竭至死[2]。伪狂犬病因其危害较大，影响范围广，已对全球养猪业的经济效益产生了严重影响 [3] [4]。在我国，随着集约规模化的养猪业的发展，猪伪狂犬病已在许多种猪场爆发，并呈现流行趋势。自国内1947 年报道该病以来，后续已有二十多个省市报道出现了该病[5]。为了能有效预防和控制猪伪狂犬病，及时诊断是关键，研究该病病毒及相关蛋白具有重要意义。
成熟的伪狂犬病毒粒子外的脂质囊膜在病毒感染和免疫原性等方面具有特殊作用，主要包括 gB、gC、gD、gE等几种糖蛋白[6]。PRV糖蛋白gD是一种重要的中和抗原，在病毒感染的病理过程中起重要作用，参与病毒的穿透过程 [7]。范伟兴等比较了多个伪狂犬病毒株的gD基因序列后，发现在核苷酸和氨基酸水平不同毒株的gD基因同源性较高，可以表明该基因具有高度保守性[8]。PRV糖蛋白gD基因大小约1.2 kb，编码402个氨基酸[9]。
以往通常使用病毒分离鉴定、PCR检测、酶联免疫吸附试验等方法来诊断猪伪狂犬病，但是存在操作过程复杂、检测周期长、特异性较差、技术要求高等缺点，使得不能及时诊断和控制猪伪狂犬病，进而影响该病的临床检测和防治[10]。
其中可利用酶联免疫吸附试验检测猪PRV抗原，排除因采用PRV疫苗进行免疫而产生的对抗体检测的干扰。ELISA检测还具有敏感、快速、高效的优势，便于工作人员完成猪伪狂犬病的鉴定和诊断，该检测方法可在临床广泛推广。因此，通过原核表达进而纯化gD蛋白用于单抗研制，显得尤为重要，为以后深入开展gD基因的功能研究以及建立检测和诊断 PRV 的方法奠定基础。
1材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 病料、菌株及载体 病料于 2017 年采自江苏省某发病猪场；pGEMT Easy Vector质粒、DH5α感受态细胞购自大连宝生物公司；pET32a 质粒由实验室保存。
1.1.2 主要仪器 PCR 仪：宝生物工程有限公司，中国大连；
4°C 冰箱：Haier，中国青岛；
20°C冰箱：美菱，中国合肥；
80°C 低温冰箱：Sanyo，日本；
高压灭菌锅：Hirayama，中国上海；
CO2培养箱：Thermo，美国；
净化工作台：中国苏州；
PH 计：Sartorius，德国；
电子天平：Sartorius，德国；
脱色摇床：金城国胜，中国常州；
恒温振荡摇床：华利达，中国太仓；
恒温水浴锅：精宏，中国上海；
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.1.1病料、菌株及载体2
1.1.2主要仪器2
1.1.3主要试剂2
1.1.4主要试剂溶液的配制2
1.2实验方法 3
1.2.1 PRV gB 基因的扩增3
1.2.1.1引物设计及合成3
1.2.1.2病料中 DNA 的提取3
1.2.1.3目的基因的扩增3
1.2.2 重组质粒 pGEMT/gD的构建3
1.2.2.1目的片段与 T 载体连接3
1.2.2.2连接产物的转化4
1.2.2.3重组质粒pGEMT/gD 的小量制备4
1.2.2.4重组质粒 pGEMT/gD 的鉴定4
1.2.3 重组质粒 pET32a/gD 的构建4
1.2.3.1载体 pET32a 的酶切回收4
1.2.3.2目的片段的回收5
1.2.3.3目的片段与表达载体片段连接5
1.2.3.4连接产物的转化5
1.2.3.5重组质粒 pET32a/gD 的小量制备5
1.2.3.6重组质粒 pET32a/gD 的双酶切鉴定5
1.2.4 重组质粒的表达与纯化5
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
1.2.4.1重组质粒的小量诱导表达5
1.2.4.2重组蛋白 SDAPAGE 电泳鉴定6
1.2.4.3重组蛋白的大量表达6
1.2.4.4重组蛋白的可溶性检测6
1.2.4.5重组蛋白的纯化6
2结果分析6
2.1目的基因片段的 PCR 扩增6
2.2目的基因的克隆与鉴定7
2.3重组质粒 pET32a/gD 的构建与鉴定7
2.4重组蛋白的鉴定8
2.5重组蛋白表达形式的鉴定8
2.6重组蛋白的纯化9
3讨论 9
致谢10
参考文献10
猪伪狂犬病毒gD基因的原核表达及蛋白纯化
引言
伪狂犬病( Pseudorabies，PR) 是由伪狂犬病病毒 ( Pseudorabies virus，PRV) 引起的具有神经症状的一种急性传染病[1] 。该病以脑脊髓炎和发热为主要特征，常引起妊娠母猪流产、产木乃伊胎等繁殖功能障碍，新生仔猪死亡率较高并伴随有神经症状，衰竭至死[2]。伪狂犬病因其危害较大，影响范围广，已对全球养猪业的经济效益产生了严重影响 [3] [4]。在我国，随着集约规模化的养猪业的发展，猪伪狂犬病已在许多种猪场爆发，并呈现流行趋势。自国内1947 年报道该病以来，后续已有二十多个省市报道出现了该病[5]。为了能有效预防和控制猪伪狂犬病，及时诊断是关键，研究该病病毒及相关蛋白具有重要意义。
成熟的伪狂犬病毒粒子外的脂质囊膜在病毒感染和免疫原性等方面具有特殊作用，主要包括 gB、gC、gD、gE等几种糖蛋白[6]。PRV糖蛋白gD是一种重要的中和抗原，在病毒感染的病理过程中起重要作用，参与病毒的穿透过程 [7]。范伟兴等比较了多个伪狂犬病毒株的gD基因序列后，发现在核苷酸和氨基酸水平不同毒株的gD基因同源性较高，可以表明该基因具有高度保守性[8]。PRV糖蛋白gD基因大小约1.2 kb，编码402个氨基酸[9]。
以往通常使用病毒分离鉴定、PCR检测、酶联免疫吸附试验等方法来诊断猪伪狂犬病，但是存在操作过程复杂、检测周期长、特异性较差、技术要求高等缺点，使得不能及时诊断和控制猪伪狂犬病，进而影响该病的临床检测和防治[10]。
其中可利用酶联免疫吸附试验检测猪PRV抗原，排除因采用PRV疫苗进行免疫而产生的对抗体检测的干扰。ELISA检测还具有敏感、快速、高效的优势，便于工作人员完成猪伪狂犬病的鉴定和诊断，该检测方法可在临床广泛推广。因此，通过原核表达进而纯化gD蛋白用于单抗研制，显得尤为重要，为以后深入开展gD基因的功能研究以及建立检测和诊断 PRV 的方法奠定基础。
1材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 病料、菌株及载体 病料于 2017 年采自江苏省某发病猪场；pGEMT Easy Vector质粒、DH5α感受态细胞购自大连宝生物公司；pET32a 质粒由实验室保存。
1.1.2 主要仪器 PCR 仪：宝生物工程有限公司，中国大连；
4°C 冰箱：Haier，中国青岛；
20°C冰箱：美菱，中国合肥；
80°C 低温冰箱：Sanyo，日本；
高压灭菌锅：Hirayama，中国上海；
CO2培养箱：Thermo，美国；
净化工作台：中国苏州；
PH 计：Sartorius，德国；
电子天平：Sartorius，德国；
脱色摇床：金城国胜，中国常州；
恒温振荡摇床：华利达，中国太仓；
恒温水浴锅：精宏，中国上海；
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