母源营养对卵母细胞发育的影响
肥胖已成为备受中国社会关注的重大公共健康问题。流行病学调查表明，肥胖会导致女性不孕不育、早产流产、胎儿发育迟缓以及先天性畸形等生殖问题。到目前为止，人们对于母源肥胖引起后代出生缺陷及跨代影响机理尚不明确。我们首先建立了HFD小鼠模型，检测到其体重、体脂和血糖等都相应升高。免疫荧光染色结果发现，HFD小鼠MII期卵母细胞的染色体排列紊乱，纺锤体结构异常。染色体延展结果进一步显示，HFD小鼠卵子的非整倍型也明显增加。这些结果均表明卵子质量受损是母源肥胖诱发相关生殖问题的一个关键因素。这为在分子生物学水平探讨母源肥胖对卵母细胞发育的影响奠定了遗传学和细胞生物学基础。深入研究卵母细胞的母源效应在肥胖对生殖结果影响过程中的介导作用,可为预防出生缺陷提供理论基础和分子靶标。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.1.1抗体和试剂2
1.1.2实验动物2
1.2实验方法 2
1.2.1 HFD小鼠模型的建立2
1.2.2卵母细胞的收集与培养3
1.2.3免疫荧光染色和共聚焦显微镜检测3
1.2.4染色体延展3
1.2.5数据分析3
2结果与分析3
2.1 HFD小鼠模型的建立3
2.2 HFD雌性小鼠MII期卵母细胞的纺锤体和染色体排列异常4
2.3 HFD小鼠卵母细胞的非整倍性增加4
3讨论5
3.1母源性肥胖对卵母细胞发育的影响5
3.2卵母细胞纺锤体、染色体排列异常和非整倍性增加对生殖结果的影响6
致谢6
参考文献6
母源营养对卵母细胞发育的影响
引言
随着我国经济的快速发展，人们的生活方式发生了显著变化，尤其是膳食结构改变及运动缺乏，肥胖已成为一个备受社会关注的重大公共健康问题。大量的流行病学调查表明，母源性肥胖会显著增加产妇及及其后代的发病和死亡风险，包括死产、流产、早产、新生儿死亡、先天性畸形、先兆子痫及妊娠糖 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
尿病等。特别值得注意的是，孕前严重肥胖的妇女常常会生产生长迟缓或小于胎龄的婴儿[1]。而且肥胖孕妇出现晚期死胎的几率也明显升高，这些死胎都明显小于来自正常体重女性的同等胎龄的死产婴儿[2]。
近些年来，一些关于人类肥胖的研究暗示，母源代谢状态对后代发育的影响最早可涉及到卵母细胞阶段。在临床辅助生殖过程中，人们也逐渐发现肥胖女性卵母细胞的发育和成熟的确存在缺陷。众所周知，与正常人群相比，肥胖妇女的妊娠率和活产率显著降低，并呈现出体质指数依赖性的方式。但是，一项对15万例肥胖女性的研究证实，用供卵代替患者自身卵子可以明显地预防上述生殖问题[3]。这一发现表明了肥胖女性的卵母细胞质量普遍低劣，且可能进一步参与引起了临床所见的出生缺陷。不过，由于技术限制和伦理问题，这一猜想尚不能在人类身上予以验证。
到目前为止，人们对于母源肥胖引起后代出生缺陷及跨代影响机理尚不明确。一些工作基础表明，卵母细胞质量受损是母源肥胖诱发相关生殖问题的一个关键因素。而且，这种卵母细胞效应直到胚胎发育晚期才有所表现，提示表观机制可能介导了该过程。基因印记主要通过表观机制，即差异的DNA甲基化方式来控制亲本等位基因在子代中的选择性表达。哺乳动物基因的印记过程包括印记去除、印记建立和印记维持三个步骤。在配子形成早期，来自父母双方的印记全部被消除，父方等位基因在精母细胞形成精子时产生新的甲基化模式，母方等位基因甲基化模式在卵子发生时形成。印记维持始于胚胎发育时期，主要包括在主动去甲基化过程中保护父源印记，以及在被动去甲基化过程中保护母源印记[4]从目前发现的印记基因来看，父方对胚胎的贡献是加速其发育，而母方则是限制胚胎发育速度[5]。当父本基因印记调节发生错误常常会导致胎儿生长迟缓。母源基因印记缺陷一般只会促使胎儿过分生长。因此，从基因印记的角度研究母源肥胖对卵母细胞和胚胎发育的影响具有重要意义。本研究将以高脂食物诱导的肥胖小鼠为模型，应用遗传学、分子生物学和细胞生物学等多学科交叉手段，拟对上述设想予以验证，以揭示卵母细胞的母源效应在肥胖对生殖结果影响过程中的介导作用，为预防出生缺陷提供理论基础和分子靶标。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 抗体和试剂
小鼠单克隆抗体antiɑtubulinFITC购自sigma公司，其它所有化学试剂盒、培养液均购自sigma公司（St.Louis，MO，USA）。
1．1．2 实验动物
本试验选用3～4周ICR雌性小鼠，用于获取GV期卵母细胞。所有试验经大学动物保护与使用委员会批准。
1．2 试验方法
1．2．1 HFD小鼠模型的建立
给3周龄雌性ICR小鼠持续饲喂高脂饲料16周，并测定相关参数，包括体重、体脂和血糖。
1．2．2 卵母细胞的收集与培养
分别从正常饲喂和HFD雌性小鼠卵巢中取出停留在GV期的卵母细胞，通过反复移液，移除卵母细胞周围的颗粒细胞。将GV期卵母细胞置于M2中，覆盖一层石蜡油，放入37℃含5% CO2的培养箱中培养。培养不同时间以获得不同时期的卵用于免疫荧光染色。
1．2．3 免疫荧光染色和共聚焦显微镜检测
将卵母细胞置于含4%多聚甲醛的PBS液中室温固定30min；然后用0.5%Triton X100透膜20min；再将卵母细胞移入含1%BSA的PBS中封闭1h；然后用小鼠单克隆抗体antiɑtubulinFITC4℃孵育过夜。次日，卵母细胞用洗脱缓冲液（含0.1%Tween 20和0.01%Triton X100的PBS）洗三次，每次5min；接着用propidium iodide（PI）染核10min，于PBS液中洗三次后将卵母细胞置于载玻片上的抗荧光淬灭封片液中进行封片，再在激光扫描共聚焦显微镜（LSM 710；Carl Zeiss，Oberkochen，Germany）下检测。在×40镜下找到目标对象，观察FITC标记的荧光采用488nm的激光，观察PI标记的荧光采用561nm的激光。
1．2．4 染色体延展
口吸管吸取20个活卵到37度1%的柠檬酸三钠液滴中20分钟（置于湿盒）。逐个转移两个卵子到载玻片上，注意不要吸过多的柠檬酸钠液体。用枪吸15微升配好的甲醇乙酸混合物从1.5厘米高处垂直砸向卵子，注意枪头使用前先用剪刀剪一下，扩大枪头顶部开口易于混合液滴下落。在混合液干燥前迅速标记卵子的位置。晾干后加PI染色液，待PI染色液未干时加盖玻片。显微镜下观察并拍照。
1．2．5 数据分析
本试验每个处理至少三个重复，数据采用方差分析进行统计，采用多重比较进行不同组间的差异比较，数据用平均数±标准差表示，P<0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2．1 HFD小鼠模型的建立
为了建立高脂食物（high fat diet）饲喂的小鼠模型（以下简称HFD小鼠），我们给3周龄雌性小鼠持续饲喂高脂饲料16周，并测定了相关参数（包括体重、体脂和血糖）予以确认，结果见图1和表1。正常饲喂的对照组小鼠体重在32克左右，而HFD小鼠平均达到71克。在体脂方面，HFD小鼠体脂超过对照组的两倍，血糖也相应的升高，由90上升至130。这表明我们建立的HFD小鼠模型很成功，这为后续实验建立的基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.1.1抗体和试剂2
1.1.2实验动物2
1.2实验方法 2
1.2.1 HFD小鼠模型的建立2
1.2.2卵母细胞的收集与培养3
1.2.3免疫荧光染色和共聚焦显微镜检测3
1.2.4染色体延展3
1.2.5数据分析3
2结果与分析3
2.1 HFD小鼠模型的建立3
2.2 HFD雌性小鼠MII期卵母细胞的纺锤体和染色体排列异常4
2.3 HFD小鼠卵母细胞的非整倍性增加4
3讨论5
3.1母源性肥胖对卵母细胞发育的影响5
3.2卵母细胞纺锤体、染色体排列异常和非整倍性增加对生殖结果的影响6
致谢6
参考文献6
母源营养对卵母细胞发育的影响
引言
随着我国经济的快速发展，人们的生活方式发生了显著变化，尤其是膳食结构改变及运动缺乏，肥胖已成为一个备受社会关注的重大公共健康问题。大量的流行病学调查表明，母源性肥胖会显著增加产妇及及其后代的发病和死亡风险，包括死产、流产、早产、新生儿死亡、先天性畸形、先兆子痫及妊娠糖 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
尿病等。特别值得注意的是，孕前严重肥胖的妇女常常会生产生长迟缓或小于胎龄的婴儿[1]。而且肥胖孕妇出现晚期死胎的几率也明显升高，这些死胎都明显小于来自正常体重女性的同等胎龄的死产婴儿[2]。
近些年来，一些关于人类肥胖的研究暗示，母源代谢状态对后代发育的影响最早可涉及到卵母细胞阶段。在临床辅助生殖过程中，人们也逐渐发现肥胖女性卵母细胞的发育和成熟的确存在缺陷。众所周知，与正常人群相比，肥胖妇女的妊娠率和活产率显著降低，并呈现出体质指数依赖性的方式。但是，一项对15万例肥胖女性的研究证实，用供卵代替患者自身卵子可以明显地预防上述生殖问题[3]。这一发现表明了肥胖女性的卵母细胞质量普遍低劣，且可能进一步参与引起了临床所见的出生缺陷。不过，由于技术限制和伦理问题，这一猜想尚不能在人类身上予以验证。
到目前为止，人们对于母源肥胖引起后代出生缺陷及跨代影响机理尚不明确。一些工作基础表明，卵母细胞质量受损是母源肥胖诱发相关生殖问题的一个关键因素。而且，这种卵母细胞效应直到胚胎发育晚期才有所表现，提示表观机制可能介导了该过程。基因印记主要通过表观机制，即差异的DNA甲基化方式来控制亲本等位基因在子代中的选择性表达。哺乳动物基因的印记过程包括印记去除、印记建立和印记维持三个步骤。在配子形成早期，来自父母双方的印记全部被消除，父方等位基因在精母细胞形成精子时产生新的甲基化模式，母方等位基因甲基化模式在卵子发生时形成。印记维持始于胚胎发育时期，主要包括在主动去甲基化过程中保护父源印记，以及在被动去甲基化过程中保护母源印记[4]从目前发现的印记基因来看，父方对胚胎的贡献是加速其发育，而母方则是限制胚胎发育速度[5]。当父本基因印记调节发生错误常常会导致胎儿生长迟缓。母源基因印记缺陷一般只会促使胎儿过分生长。因此，从基因印记的角度研究母源肥胖对卵母细胞和胚胎发育的影响具有重要意义。本研究将以高脂食物诱导的肥胖小鼠为模型，应用遗传学、分子生物学和细胞生物学等多学科交叉手段，拟对上述设想予以验证，以揭示卵母细胞的母源效应在肥胖对生殖结果影响过程中的介导作用，为预防出生缺陷提供理论基础和分子靶标。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 抗体和试剂
小鼠单克隆抗体antiɑtubulinFITC购自sigma公司，其它所有化学试剂盒、培养液均购自sigma公司（St.Louis，MO，USA）。
1．1．2 实验动物
本试验选用3～4周ICR雌性小鼠，用于获取GV期卵母细胞。所有试验经大学动物保护与使用委员会批准。
1．2 试验方法
1．2．1 HFD小鼠模型的建立
给3周龄雌性ICR小鼠持续饲喂高脂饲料16周，并测定相关参数，包括体重、体脂和血糖。
1．2．2 卵母细胞的收集与培养
分别从正常饲喂和HFD雌性小鼠卵巢中取出停留在GV期的卵母细胞，通过反复移液，移除卵母细胞周围的颗粒细胞。将GV期卵母细胞置于M2中，覆盖一层石蜡油，放入37℃含5% CO2的培养箱中培养。培养不同时间以获得不同时期的卵用于免疫荧光染色。
1．2．3 免疫荧光染色和共聚焦显微镜检测
将卵母细胞置于含4%多聚甲醛的PBS液中室温固定30min；然后用0.5%Triton X100透膜20min；再将卵母细胞移入含1%BSA的PBS中封闭1h；然后用小鼠单克隆抗体antiɑtubulinFITC4℃孵育过夜。次日，卵母细胞用洗脱缓冲液（含0.1%Tween 20和0.01%Triton X100的PBS）洗三次，每次5min；接着用propidium iodide（PI）染核10min，于PBS液中洗三次后将卵母细胞置于载玻片上的抗荧光淬灭封片液中进行封片，再在激光扫描共聚焦显微镜（LSM 710；Carl Zeiss，Oberkochen，Germany）下检测。在×40镜下找到目标对象，观察FITC标记的荧光采用488nm的激光，观察PI标记的荧光采用561nm的激光。
1．2．4 染色体延展
口吸管吸取20个活卵到37度1%的柠檬酸三钠液滴中20分钟（置于湿盒）。逐个转移两个卵子到载玻片上，注意不要吸过多的柠檬酸钠液体。用枪吸15微升配好的甲醇乙酸混合物从1.5厘米高处垂直砸向卵子，注意枪头使用前先用剪刀剪一下，扩大枪头顶部开口易于混合液滴下落。在混合液干燥前迅速标记卵子的位置。晾干后加PI染色液，待PI染色液未干时加盖玻片。显微镜下观察并拍照。
1．2．5 数据分析
本试验每个处理至少三个重复，数据采用方差分析进行统计，采用多重比较进行不同组间的差异比较，数据用平均数±标准差表示，P<0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2．1 HFD小鼠模型的建立
为了建立高脂食物（high fat diet）饲喂的小鼠模型（以下简称HFD小鼠），我们给3周龄雌性小鼠持续饲喂高脂饲料16周，并测定了相关参数（包括体重、体脂和血糖）予以确认，结果见图1和表1。正常饲喂的对照组小鼠体重在32克左右，而HFD小鼠平均达到71克。在体脂方面，HFD小鼠体脂超过对照组的两倍，血糖也相应的升高，由90上升至130。这表明我们建立的HFD小鼠模型很成功，这为后续实验建立的基础。
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