猪捷申病毒8型全基因测序与分析
本研究应用PK细胞，对一株猪捷申病毒(PTV JS2013)进行病毒培养和TCID50测定，参考GenBank上的PTV F65毒株（AJ011380）基因组序列，设计合成8段特异性引物对此病毒株进行了PT-PCR及克隆测序，应用DNAStar对病毒全基因组序列进行拼接，并与国内外45株不同血清型的PTV全基因序列以及16个PTV毒株的VP1基因序列分别进行了同源性比较及系统进化树分析。测序结果表明该株猪捷申病毒全基因组序列长度为7119bp（不包括polyA）。系统进化树分析与同源性分析表明该株病毒属于PTV-8型血清型，与国内分离的Jilin/2003/2（JN710381）和Fuyu/2009（HQ020378）亲缘关系最近，为研究该病毒的毒株特性及遗传变异提供了参考。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 3
1 材料与方法 2
1．1 主要材料 2
1．1．1 细胞、病毒株、菌种和载体 2
1．1．2 生物制剂 2
1．1．3 主要溶液的配制 2
1．1．4 其他实验器材及设备 2
1．2 病毒分离 2
1．2．1 细胞的培养 2
1．2．2 病毒的接种与收获 2
1．2．3 病毒的纯化及病毒细胞半数感染量 (TCID50) 的测定 2
1．3 病毒总RNA的提取 3
1．4 引物的设计与合成 3
1．5 PTV 的RTPCR扩增 4
1．6 重组质粒的构建 4
1．7 连接产物的转化及质粒的提取 4
1.7.1转化 4
1.7.2 提取质粒 4
1．8 分离株全基因核苷酸序列比较及系统进化分析 4
2 结果与分析 5
2．1 病毒培养以及TCID50的测定 5
2．2 RTPCR鉴定 5
2. 3 系统进化树分析 6
2．4 基因核苷酸序列分析 8
3 讨论
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
8
致谢 9
参考文献 10
图1 分离株接种PK细胞24小时后细胞病5图2 PTV S3、S4基因片段RTPCR电泳图 5图3 PTV S1、S8基因片段RTPCR电泳图 5图4 PTV S2、S5、S6、S7基因片段RTPCR电泳图 6图5 分离株PTV JS2013全基因系统进化树结构7图6 分离株PTV JS2013 VP1基因系统进化树结构8图7 部分PTV毒株全基因核苷酸的同源性比较 8表1 引物序列4
猪捷申病毒8型全基因序列测定与分析
引言
猪捷申病毒（Porcine teschovirus，PTV）属于微RNA病毒科，猪捷申病毒属，可引起猪的脑脊髓灰质炎、下痢、肺炎、繁殖障碍、心包炎和心肌炎、皮肤损伤等多种临床症状[1,2]，由此病毒引起的猪捷申病最早发现于原捷克斯洛伐克一个叫捷申的小城，当时造成了高达90%以上的病死率。最近40年间，该病蔓延到欧洲，且在北美、澳大利亚、非洲等地相继出现[3,4]。2003年，哈尔滨兽医研究所在我国内蒙古初次分离鉴定到了一株1型猪捷申病毒[5]，近年来，关于PTV流行病学调查报告显示，在我国及周围国家与地区大部分猪场均有感染，如韩国、泰国，台湾等[6,7,8,9]，目前在我国主要表现为混合感染，尤其与猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪圆环病毒II型（PCV2）混合感染较多[10]，其广泛传播和快速蔓延给世界养猪业带来了十分严重的经济亏损。
PTV为单股正链RNA，大小约7.2 kb，仅含1个完整的开放阅读框（ORF），ORF编码1个多聚蛋白，多聚蛋白最终裂解为前导蛋白L，结构蛋白VP4、VP2、VP3、VP1 和非结构蛋白 2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D [11,12,13]。PTV至少有11个血清型，不同的血清型除了其本身的基因组序列存在差异外，它们感染猪群后，表现出的病症和严重程度也有所不同。本研究应用 PK 细胞，对实验室分离的一株猪捷申病毒进行空斑纯化与毒力测试，并设计引物对全基因序列进行了分段扩增、克隆、拼接及序列分析，以期为研究该病毒的毒株特性及其在我国的遗传变异情况提供参考。
1 材料与方法
1．1 主要材料
1．1．1 细胞、病毒株、菌种和载体 猪肾细胞（PK）购自 ATCC；PTV JS2013 病毒株由江苏省农科院兽医研究所分离；DH5α感受态细胞由江苏省农业科学院兽医研究所70℃保存备用；pMD 18T克隆载体购自 TaKaRa 公司。
1．1．2 生物制剂 培养基 DMEM、新生牛血清（FBS）及胰蛋白酶均购自 GIBCO 公司；Trizol LS Reagent 为美国 Invitrogen 公司产品；反转录试剂盒为天为公司产品；HSTMMix 购自东盛公司；DNA Marker DL 2000购自 TaKaRa 公司；Agarose Gel DNA Purification Kit 购自 Axygen 公司；质粒提取试剂盒购自康宁生命科学有限公司；胶回收试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。
1．1．3 主要溶液的配制 本实验主要用到以下溶液：
(1) Hank’s 液：
A液：称取葡萄糖 1 g，酚红 0.01 g，KH2PO4 0.06 g，Na2HPO412H2O 0.12 g，加dd H2O定容至1 L。
B液：称取CaCl2 0.28 g，MgSO47H2O 0.09 g，MgCl26H2O 0.1 g，NaCl 8 g，KCl 0.4 g，NaHCO3 0.35~0.5 g，加dd H2O定容至1 L。
A、B液分别高压，用前混合，调pH至7.0。
(2) 细胞营养液：在50 mL的DMEM 液中加入5 mL的犊牛血清和1 mL双抗。
(3) 细胞维持液：在50 mL的DMEM 液中加入1 mL的犊牛血清和1 mL双抗。
(4) 50×TAE缓冲液：称取Tris 242 g，Na2EDTA2H2O 37.2 g，加入800 mL dd H2O 搅拌溶解，加入57.1 mL醋酸，加dd H2O定容至1 L。
(5) 1×TAE缓冲液：取50×TAE缓冲液50倍稀释。
1．1．4 其他实验器材及设备 倒置显微镜(Olympus)；CO2细胞培养箱(Thermo Scientific)；PCR Thermal Cycler Dice TP600 (Takara)；高速冷冻离心机(Hettich)；DYCP31D型水平电泳槽；THZC恒温震荡器(太仓实验仪器厂)。
1．2 病毒分离
1．2．1 细胞的培养 将细胞营养液和0.25%胰蛋白酶液放入37 ℃温箱内预热，取铺满单层的PK细胞，倾弃原来的营养液，用 Hank’s 液轻轻洗细胞3次。在每个细胞瓶中加入3~4 ml胰酶，于37℃温箱中消化3~5 min。当细胞变圆且彼此开始分离，将消化液倾出，继续消化1~2 min，再加入少量营养液轻晃冲洗细胞层后倾弃。向细胞瓶中先加入适量营养液，反复吹打分散细胞，再视细胞的生长状况逐步追加营养液至所需量，按照传代的比例（1:21:3）补加适当体积的营养液，置于37 ℃二氧化碳培养箱中培养。第2~4天换液，在细胞快铺满单层时接种分离到的PTV。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 3
1 材料与方法 2
1．1 主要材料 2
1．1．1 细胞、病毒株、菌种和载体 2
1．1．2 生物制剂 2
1．1．3 主要溶液的配制 2
1．1．4 其他实验器材及设备 2
1．2 病毒分离 2
1．2．1 细胞的培养 2
1．2．2 病毒的接种与收获 2
1．2．3 病毒的纯化及病毒细胞半数感染量 (TCID50) 的测定 2
1．3 病毒总RNA的提取 3
1．4 引物的设计与合成 3
1．5 PTV 的RTPCR扩增 4
1．6 重组质粒的构建 4
1．7 连接产物的转化及质粒的提取 4
1.7.1转化 4
1.7.2 提取质粒 4
1．8 分离株全基因核苷酸序列比较及系统进化分析 4
2 结果与分析 5
2．1 病毒培养以及TCID50的测定 5
2．2 RTPCR鉴定 5
2. 3 系统进化树分析 6
2．4 基因核苷酸序列分析 8
3 讨论
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
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致谢 9
参考文献 10
图1 分离株接种PK细胞24小时后细胞病5图2 PTV S3、S4基因片段RTPCR电泳图 5图3 PTV S1、S8基因片段RTPCR电泳图 5图4 PTV S2、S5、S6、S7基因片段RTPCR电泳图 6图5 分离株PTV JS2013全基因系统进化树结构7图6 分离株PTV JS2013 VP1基因系统进化树结构8图7 部分PTV毒株全基因核苷酸的同源性比较 8表1 引物序列4
猪捷申病毒8型全基因序列测定与分析
引言
猪捷申病毒（Porcine teschovirus，PTV）属于微RNA病毒科，猪捷申病毒属，可引起猪的脑脊髓灰质炎、下痢、肺炎、繁殖障碍、心包炎和心肌炎、皮肤损伤等多种临床症状[1,2]，由此病毒引起的猪捷申病最早发现于原捷克斯洛伐克一个叫捷申的小城，当时造成了高达90%以上的病死率。最近40年间，该病蔓延到欧洲，且在北美、澳大利亚、非洲等地相继出现[3,4]。2003年，哈尔滨兽医研究所在我国内蒙古初次分离鉴定到了一株1型猪捷申病毒[5]，近年来，关于PTV流行病学调查报告显示，在我国及周围国家与地区大部分猪场均有感染，如韩国、泰国，台湾等[6,7,8,9]，目前在我国主要表现为混合感染，尤其与猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪圆环病毒II型（PCV2）混合感染较多[10]，其广泛传播和快速蔓延给世界养猪业带来了十分严重的经济亏损。
PTV为单股正链RNA，大小约7.2 kb，仅含1个完整的开放阅读框（ORF），ORF编码1个多聚蛋白，多聚蛋白最终裂解为前导蛋白L，结构蛋白VP4、VP2、VP3、VP1 和非结构蛋白 2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D [11,12,13]。PTV至少有11个血清型，不同的血清型除了其本身的基因组序列存在差异外，它们感染猪群后，表现出的病症和严重程度也有所不同。本研究应用 PK 细胞，对实验室分离的一株猪捷申病毒进行空斑纯化与毒力测试，并设计引物对全基因序列进行了分段扩增、克隆、拼接及序列分析，以期为研究该病毒的毒株特性及其在我国的遗传变异情况提供参考。
1 材料与方法
1．1 主要材料
1．1．1 细胞、病毒株、菌种和载体 猪肾细胞（PK）购自 ATCC；PTV JS2013 病毒株由江苏省农科院兽医研究所分离；DH5α感受态细胞由江苏省农业科学院兽医研究所70℃保存备用；pMD 18T克隆载体购自 TaKaRa 公司。
1．1．2 生物制剂 培养基 DMEM、新生牛血清（FBS）及胰蛋白酶均购自 GIBCO 公司；Trizol LS Reagent 为美国 Invitrogen 公司产品；反转录试剂盒为天为公司产品；HSTMMix 购自东盛公司；DNA Marker DL 2000购自 TaKaRa 公司；Agarose Gel DNA Purification Kit 购自 Axygen 公司；质粒提取试剂盒购自康宁生命科学有限公司；胶回收试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。
1．1．3 主要溶液的配制 本实验主要用到以下溶液：
(1) Hank’s 液：
A液：称取葡萄糖 1 g，酚红 0.01 g，KH2PO4 0.06 g，Na2HPO412H2O 0.12 g，加dd H2O定容至1 L。
B液：称取CaCl2 0.28 g，MgSO47H2O 0.09 g，MgCl26H2O 0.1 g，NaCl 8 g，KCl 0.4 g，NaHCO3 0.35~0.5 g，加dd H2O定容至1 L。
A、B液分别高压，用前混合，调pH至7.0。
(2) 细胞营养液：在50 mL的DMEM 液中加入5 mL的犊牛血清和1 mL双抗。
(3) 细胞维持液：在50 mL的DMEM 液中加入1 mL的犊牛血清和1 mL双抗。
(4) 50×TAE缓冲液：称取Tris 242 g，Na2EDTA2H2O 37.2 g，加入800 mL dd H2O 搅拌溶解，加入57.1 mL醋酸，加dd H2O定容至1 L。
(5) 1×TAE缓冲液：取50×TAE缓冲液50倍稀释。
1．1．4 其他实验器材及设备 倒置显微镜(Olympus)；CO2细胞培养箱(Thermo Scientific)；PCR Thermal Cycler Dice TP600 (Takara)；高速冷冻离心机(Hettich)；DYCP31D型水平电泳槽；THZC恒温震荡器(太仓实验仪器厂)。
1．2 病毒分离
1．2．1 细胞的培养 将细胞营养液和0.25%胰蛋白酶液放入37 ℃温箱内预热，取铺满单层的PK细胞，倾弃原来的营养液，用 Hank’s 液轻轻洗细胞3次。在每个细胞瓶中加入3~4 ml胰酶，于37℃温箱中消化3~5 min。当细胞变圆且彼此开始分离，将消化液倾出，继续消化1~2 min，再加入少量营养液轻晃冲洗细胞层后倾弃。向细胞瓶中先加入适量营养液，反复吹打分散细胞，再视细胞的生长状况逐步追加营养液至所需量，按照传代的比例（1:21:3）补加适当体积的营养液，置于37 ℃二氧化碳培养箱中培养。第2~4天换液，在细胞快铺满单层时接种分离到的PTV。
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