五株乳杆菌培养液体外抑菌筛选试验
五株乳杆菌培养液体外抑菌筛选试验[20200507185819]
摘要：乳杆菌（Lactobacillus）即是乳酸杆菌，为细菌的一科，乳杆菌是一种常见的益生菌。本课题试验利用现有五株已知的乳杆菌：L.acidophilus 嗜酸乳杆菌、L. rhamosus 鼠李糖乳杆菌、L. reuteri 罗伊氏乳杆菌、L. plantarum 植物乳杆菌、L. salivarius 唾液乳杆菌，用它们单个或组合的培养液滤液抑制三种目标菌：肠埃希氏菌(E.coli)、克雷伯氏杆菌(K.pneumoniae)、假单胞菌（Pseudomonadaceae）。在对其进行体外抑菌的试验中，根据其抑菌圈的大小筛选出抑菌效果较好的乳杆菌或其组合，后续可以在动物养殖的临床应用中发挥作用。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
关键字:乳杆菌；体外；抑菌试验
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 试验菌株 2
1.1.2 主要试剂 2
1.1.3 主要器材 2
1.2 方法 2
1.2.1 试验前准备2
1.2.2 乳杆菌的复苏与保种2
1.2.3 目标菌的培养与保种2
1.2.4 抑菌试验流程2
2 结果与分析3
2.1 结果3
2.1.1 pH值测定结果3
2.1.2 单株乳杆菌抑制目标菌的试验结果4
2.2单株乳杆菌抑菌结果分析5
2.3 组合乳杆菌抑菌结果5
2.4 组合乳杆菌抑菌结果分析6
3 讨论 6
致谢9
参考文献10
五株乳杆菌培养液体外抑菌筛选试验
引言
乳杆菌Lactobacillus即是乳酸杆菌，为细菌的一科，耐酸性强，最适pH值为5.5～5.8，甚至更低。在37℃下生长良好，不耐高温，当80℃高温处理5min后，乳杆菌将损失70%~80%[1]。革兰氏染色呈阳性，无芽孢杆菌。乳杆菌科仅包括乳杆菌属一属，该属细菌 分解糖的能力强[2]，分解糖类产生乳酸，但是其分解蛋白质类的能力极低。
乳杆菌是一种常见的益生菌[2]，益生菌（probiotics）是专指通 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
过改变肠道菌群平衡而对宿主起保健作用的一类微生物。对其在食品、医学、农业中的研究较多[3~9]：把它加入饲料中，在提高动物生长速度、增强动物机体免疫力[10]、预防和治疗疾病、提高动物存活率、改善饲料利用率[11]等方面发挥着显著的作用，目前其作用机理的研究已越来越受到人们的重视。
本课题试验对现有五株已知的乳杆菌：L.acidophilus嗜酸乳杆菌、L. rhamosus 鼠李糖乳杆菌、L.reuteri 罗伊氏乳杆菌、L. plantarum 植物乳杆菌、L. salivarius唾液乳杆菌，用它们单个或组合在体外培养抑制三种目标菌：肠埃希氏菌(E. coli)、克雷伯氏杆菌(K.pneumoniae)、假单胞菌（Pseudomonadaceae）。
在对其进行体外抑菌的试验中，根据其抑菌圈的大小得出抑菌效果较好的乳杆菌或其组合，这可以为乳杆菌的抑菌研究提供一个良好的证明，后续可以在动物养殖的临床应用中发挥作用。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 试验菌株
L.acidophilus嗜酸乳杆菌、L.rhamosus 鼠李糖乳杆菌、L.reuteri 罗伊氏乳杆菌、L.plantarum 植物乳杆菌、L.salivarius唾液乳杆菌。购自台湾亚芯生物技术有限公司。
肠埃希氏菌(E. coli)、克雷伯氏杆菌(K.pneumoniae)、假单胞菌（Pseudomonadaceae）。为上海交通大学生命科学与技术学院微生物实验室保存。
1．1．2 主要试剂
乳杆菌肉汤培养基（成分：胨化乳：15.0 g/L、酵母浸粉：5.0 g/L、磷酸二氢钾：2.0 g/L、葡萄糖：10.0 g/L、番茄浸出粉：2.5 g/L、吐温80：1.0 g/L）、蛋白胨粉、酵母粉、氯化钠、琼脂粉。
1．1．3 主要器材
10ml试管、一次性医用培养皿、滤纸片、0.45μm水相过滤膜、2.5ml一次性注射器、高温高压灭菌器、震荡培养箱、恒温培养箱、超净操作台等。
1．2 方法
1．2．1 试验前准备
1、乳杆菌肉汤液体培养基：称取乳杆菌肉汤培养基粉35.5g，加热溶解于1000ml蒸馏水中（或按比例配制），分装于洗净的试管中，每管5ml。
2、LB液体培养基：称取蛋白胨粉10g，酵母粉5g，氯化钠8g，加热溶解于1000ml蒸馏水中（或按比例配制），分装于洗净的试管中，每管5ml。
3、LB固体培养基：称取蛋白胨粉10g，酵母粉5g，氯化钠8g，加热溶解于1000ml蒸馏水中（或按比例配制）。
将配好的试剂121℃高压灭菌15分钟后，4℃保存备用。
在超净台中，将LB固体培养基趁热倒于一次性培养皿中，制成厚度约5mm的平板，冷却凝固，4℃保存备用。
试验中所需要的滤纸片需要紫外照射消毒后，将装有滤纸片的小玻璃瓶放置于超净操作台中备用。
1．2．2 乳杆菌复苏与保种
用接种环取少量乳杆菌冻干粉接种于乳杆菌肉汤培养基中，37℃震荡培养36h进行复苏活化。复苏的菌液和50%的甘油以1：1的比例混匀-20℃保种待用。剩下的乳杆菌粉密封装好-80℃封存。 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
/> 1．2．3 目标菌培养与保种
挑取平板培养基上目标菌的单菌落，接种到LB液体培养基中震荡培养24h。具体培养温度视不同目标菌而定，肠埃希氏菌(E. coli)和克雷伯氏杆菌(K.pneumoniae)为37℃振荡培养，假单胞菌（Pseudomonadaceae）为30℃振荡培养。然后同样将菌液和50%的甘油以1：1的比例混匀-20℃保种待用。
1．2．4 抑菌试验流程
将保种的每种乳杆菌菌液100μL分别接入三支液体肉汤培养基试管37℃震荡培养，分别培养12小时，24小时，36小时之后，用一次性无菌注射器吸取菌液通过0.45μm的水相滤膜过滤，留取滤液于EP管中，用pH试纸测得滤液的pH值，在滤液中浸泡滤纸片，待用。
两种组合的乳杆菌，每种吸取菌液50μL接入同一支液体肉汤培养基试管37℃振荡培养对应的时间。用一次性无菌注射器吸取菌液通过0.45μm的水相滤膜过滤，留取滤液于EP管中，在滤液中浸泡滤纸片，待用。
三种组合的乳杆菌，每种吸取菌液35μL接入同一支液体肉汤培养基试管37℃振荡培养对应的时间。用一次性无菌注射器吸取菌液通过0.45μm的水相滤膜过滤，留取滤液于EP管中，在滤液中浸泡滤纸片，待用。
保种的目标菌先吸取100μL菌液在LB液体培养基试管中培养24小时后，从试管中吸取100μL菌液于LB固体培养皿上用玻璃涂布器均匀涂布。肠埃希氏菌(E. coli)和克雷伯氏杆菌(K.pneumoniae)的适宜培养温度为37℃，假单胞菌(Pseudomonadaceae)的适宜培养温度为30℃。
根据需要将不同时间不同种菌的滤液以及组合的滤液浸泡的滤纸片贴于涂布目标菌液的LB固体培养基上，以目标菌适宜的温度培养5小时观察结果。
测得抑菌圈的大小，根据结果分析，从而得出结论。
唾液乳杆菌 4.0 3.5 3.0
嗜酸乳杆菌 6.0 3.5 3.0
鼠李糖乳杆菌 4.0 3.5 4.0
罗伊氏乳杆菌 5.5 5.5 5.5
摘要：乳杆菌（Lactobacillus）即是乳酸杆菌，为细菌的一科，乳杆菌是一种常见的益生菌。本课题试验利用现有五株已知的乳杆菌：L.acidophilus 嗜酸乳杆菌、L. rhamosus 鼠李糖乳杆菌、L. reuteri 罗伊氏乳杆菌、L. plantarum 植物乳杆菌、L. salivarius 唾液乳杆菌，用它们单个或组合的培养液滤液抑制三种目标菌：肠埃希氏菌(E.coli)、克雷伯氏杆菌(K.pneumoniae)、假单胞菌（Pseudomonadaceae）。在对其进行体外抑菌的试验中，根据其抑菌圈的大小筛选出抑菌效果较好的乳杆菌或其组合，后续可以在动物养殖的临床应用中发挥作用。
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关键字:乳杆菌；体外；抑菌试验
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 试验菌株 2
1.1.2 主要试剂 2
1.1.3 主要器材 2
1.2 方法 2
1.2.1 试验前准备2
1.2.2 乳杆菌的复苏与保种2
1.2.3 目标菌的培养与保种2
1.2.4 抑菌试验流程2
2 结果与分析3
2.1 结果3
2.1.1 pH值测定结果3
2.1.2 单株乳杆菌抑制目标菌的试验结果4
2.2单株乳杆菌抑菌结果分析5
2.3 组合乳杆菌抑菌结果5
2.4 组合乳杆菌抑菌结果分析6
3 讨论 6
致谢9
参考文献10
五株乳杆菌培养液体外抑菌筛选试验
引言
乳杆菌Lactobacillus即是乳酸杆菌，为细菌的一科，耐酸性强，最适pH值为5.5～5.8，甚至更低。在37℃下生长良好，不耐高温，当80℃高温处理5min后，乳杆菌将损失70%~80%[1]。革兰氏染色呈阳性，无芽孢杆菌。乳杆菌科仅包括乳杆菌属
乳杆菌是一种常见的益生菌[2]，益生菌（probiotics）是专指通 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
过改变肠道菌群平衡而对宿主起保健作用的一类微生物。对其在食品、医学、农业中的研究较多[3~9]：把它加入饲料中，在提高动物生长速度、增强动物机体免疫力[10]、预防和治疗疾病、提高动物存活率、改善饲料利用率[11]等方面发挥着显著的作用，目前其作用机理的研究已越来越受到人们的重视。
本课题试验对现有五株已知的乳杆菌：L.acidophilus嗜酸乳杆菌、L. rhamosus 鼠李糖乳杆菌、L.reuteri 罗伊氏乳杆菌、L. plantarum 植物乳杆菌、L. salivarius唾液乳杆菌，用它们单个或组合在体外培养抑制三种目标菌：肠埃希氏菌(E. coli)、克雷伯氏杆菌(K.pneumoniae)、假单胞菌（Pseudomonadaceae）。
在对其进行体外抑菌的试验中，根据其抑菌圈的大小得出抑菌效果较好的乳杆菌或其组合，这可以为乳杆菌的抑菌研究提供一个良好的证明，后续可以在动物养殖的临床应用中发挥作用。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 试验菌株
L.acidophilus嗜酸乳杆菌、L.rhamosus 鼠李糖乳杆菌、L.reuteri 罗伊氏乳杆菌、L.plantarum 植物乳杆菌、L.salivarius唾液乳杆菌。购自台湾亚芯生物技术有限公司。
肠埃希氏菌(E. coli)、克雷伯氏杆菌(K.pneumoniae)、假单胞菌（Pseudomonadaceae）。为上海交通大学生命科学与技术学院微生物实验室保存。
1．1．2 主要试剂
乳杆菌肉汤培养基（成分：胨化乳：15.0 g/L、酵母浸粉：5.0 g/L、磷酸二氢钾：2.0 g/L、葡萄糖：10.0 g/L、番茄浸出粉：2.5 g/L、吐温80：1.0 g/L）、蛋白胨粉、酵母粉、氯化钠、琼脂粉。
1．1．3 主要器材
10ml试管、一次性医用培养皿、滤纸片、0.45μm水相过滤膜、2.5ml一次性注射器、高温高压灭菌器、震荡培养箱、恒温培养箱、超净操作台等。
1．2 方法
1．2．1 试验前准备
1、乳杆菌肉汤液体培养基：称取乳杆菌肉汤培养基粉35.5g，加热溶解于1000ml蒸馏水中（或按比例配制），分装于洗净的试管中，每管5ml。
2、LB液体培养基：称取蛋白胨粉10g，酵母粉5g，氯化钠8g，加热溶解于1000ml蒸馏水中（或按比例配制），分装于洗净的试管中，每管5ml。
3、LB固体培养基：称取蛋白胨粉10g，酵母粉5g，氯化钠8g，加热溶解于1000ml蒸馏水中（或按比例配制）。
将配好的试剂121℃高压灭菌15分钟后，4℃保存备用。
在超净台中，将LB固体培养基趁热倒于一次性培养皿中，制成厚度约5mm的平板，冷却凝固，4℃保存备用。
试验中所需要的滤纸片需要紫外照射消毒后，将装有滤纸片的小玻璃瓶放置于超净操作台中备用。
1．2．2 乳杆菌复苏与保种
用接种环取少量乳杆菌冻干粉接种于乳杆菌肉汤培养基中，37℃震荡培养36h进行复苏活化。复苏的菌液和50%的甘油以1：1的比例混匀-20℃保种待用。剩下的乳杆菌粉密封装好-80℃封存。
/> 1．2．3 目标菌培养与保种
挑取平板培养基上目标菌的单菌落，接种到LB液体培养基中震荡培养24h。具体培养温度视不同目标菌而定，肠埃希氏菌(E. coli)和克雷伯氏杆菌(K.pneumoniae)为37℃振荡培养，假单胞菌（Pseudomonadaceae）为30℃振荡培养。然后同样将菌液和50%的甘油以1：1的比例混匀-20℃保种待用。
1．2．4 抑菌试验流程
将保种的每种乳杆菌菌液100μL分别接入三支液体肉汤培养基试管37℃震荡培养，分别培养12小时，24小时，36小时之后，用一次性无菌注射器吸取菌液通过0.45μm的水相滤膜过滤，留取滤液于EP管中，用pH试纸测得滤液的pH值，在滤液中浸泡滤纸片，待用。
两种组合的乳杆菌，每种吸取菌液50μL接入同一支液体肉汤培养基试管37℃振荡培养对应的时间。用一次性无菌注射器吸取菌液通过0.45μm的水相滤膜过滤，留取滤液于EP管中，在滤液中浸泡滤纸片，待用。
三种组合的乳杆菌，每种吸取菌液35μL接入同一支液体肉汤培养基试管37℃振荡培养对应的时间。用一次性无菌注射器吸取菌液通过0.45μm的水相滤膜过滤，留取滤液于EP管中，在滤液中浸泡滤纸片，待用。
保种的目标菌先吸取100μL菌液在LB液体培养基试管中培养24小时后，从试管中吸取100μL菌液于LB固体培养皿上用玻璃涂布器均匀涂布。肠埃希氏菌(E. coli)和克雷伯氏杆菌(K.pneumoniae)的适宜培养温度为37℃，假单胞菌(Pseudomonadaceae)的适宜培养温度为30℃。
根据需要将不同时间不同种菌的滤液以及组合的滤液浸泡的滤纸片贴于涂布目标菌液的LB固体培养基上，以目标菌适宜的温度培养5小时观察结果。
测得抑菌圈的大小，根据结果分析，从而得出结论。
唾液乳杆菌 4.0 3.5 3.0
嗜酸乳杆菌 6.0 3.5 3.0
鼠李糖乳杆菌 4.0 3.5 4.0
罗伊氏乳杆菌 5.5 5.5 5.5
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