鹅源鸭疫里氏杆菌分离与鉴定
本次实习从有明显症状的、疑似感染鸭疫里氏杆菌的15日龄雏鹅中无菌操作采取脑、心脏、肝脏和脾病料，进行病原分离。对分离的细菌进行增殖纯化、药物敏感性试验、生化试验、血清型鉴定。此外，通过GenBank发表的JS3株的基因序列使用Primer5.0设计特异性扩增鸭疫里氏杆菌外膜蛋白A基因的引物，对分离到的细菌DNA进行PCR扩增，PCR产物进行基因序列测定，然后在NCBI上进行基因序列同源性比对。结果显示8份病料中分离到2株鸭疫里氏杆菌；分离到的鸭疫里氏杆菌对红霉素和阿奇霉素的敏感性高于其他药物；生化试验结果与报道的鸭疫里氏杆菌的生化结果相同，在琼脂糖凝胶电泳中，使用特异性引物扩增分离菌的PCR产物出现目的条带，其他细菌的PCR产物未出现目的条带；基因序列同源性比对结果显示，分离的细菌与RA-CH-2株鸭疫里氏杆菌的基因序列相似度达到99%。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Keywords 2
引言 3
1材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1 菌株来源 3
1.1.2培养基及主要试剂 3
1.1.3 仪器 4
1.2 方法 4
1.2.1 细菌的分离培养及纯化 4
1.2.2 细菌的染色镜检与增殖纯化培养 4
1.2.3 细菌药敏试验 5
1.2.4 细菌生化试验 5
1.2.5血清型鉴定（玻片凝集试验） 5
1.2.6细菌DNA的PCR扩增 5
1.2.7 琼脂糖凝胶电泳及基因序列测定、同源性比对 6
2 结果 6
2.1 细菌分离培养结果 6
2.2 细菌染色镜检结果 6
2.3细菌药敏试验结果 7
2.4细菌生化试验结果 7
2.5 血清型鉴定结果 7
2.6 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果 8
2.7 PCR产物基因序列测定及同源性比对结果 8
3 分析讨论 9
致谢 9
参考文献 10
附录A 12
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
图1. TSA平板分离的细菌单菌落 6
图2. TSA纯化的分离菌单菌落 6
图3. 革兰氏染色镜检结果 7
图4. 瑞氏染色结果 7
图5. PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果 8
表1. 分离细菌的药敏试验结果 7
表2. 分离细菌的生化试验结果 7
鹅源鸭疫里氏杆菌分离与鉴定
引言
引言
鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌（Riemerella anatipestifer，简称RA）感染导致的急性或慢性、接触性、败血性传染病[1]。鹅的里氏杆菌感染曾被成为鹅流感或鹅渗出性败血症。鸭疫里氏杆菌主要侵害家鸭、家鹅、火鸡和多种家禽和野禽。该病发病率较高，约10—30%[2]，该病广泛分布与世界上多个国家和地区，是目前造成养鸭业、养鹅业经计损失的主要细菌性传染病之一。
鸭疫里氏杆菌曾被称为鸭疫巴氏杆菌，后Rossau等（1991）和Segers（1993）证实，该菌的rRNA与巴氏杆菌属的不同源，与黄杆菌等相近，因此建立里氏杆菌属，归于黄杆菌科[3]。鸭疫里氏杆菌为革兰氏阴性小杆菌，菌体呈杆状或椭圆形，无芽孢，不能运动，有荚膜，经瑞氏染色后，可见两极着色。该菌对营养要求比较高，普通培养基和麦康凯培养基上不生长。初次分离培养需要供给5%—10%的CO2。在TSA或巧克力平板上，生长的菌落无色素，呈圆形、表面光滑，直径1—2mm。鸭疫里氏杆菌不发酵碳水化合物，不分解吲哚、硫化氢和尿素，不还原硝酸盐、靛基质。多液化明胶。鸭疫里氏杆菌的血清型复杂，迄今为止, 国际上确认的血清型共有 21 个，地域分布广泛，最常见的为1、2、3和15型[4]。鸭疫里氏杆菌对青霉素、红霉素、林可霉素、链霉素、氨苄青霉素和新霉素等多种抗生素敏感，对卡那霉素和多粘菌素不敏感，对庆大霉素有一定的抗性[5]。但是近年来随着抗生素的普遍使用、超剂量使用等原因，鸭疫里氏杆菌的抗药性也变得越来越普遍。
鸭疫里氏杆菌对于1—8周龄的鸭、鹅都有侵害性，以往的报道中，鹅的鸭疫里氏杆菌病多见于鸭，近年来，鹅发生鸭疫里氏杆菌病的报道有所增加[68]。急性病例主要见于2—4周龄。鹅感染鸭疫里氏杆菌后，表现为困倦、缩颈，眼与鼻孔有分泌物，不食或少食，腹泻，绿色下痢。濒死前出现神经临诊症状：头颈震颤、角弓反张，尾部摇摆，不久抽搐死亡。病理变化特点为纤维素性心包炎、肝周炎。气囊炎、干酪性输卵管炎和脑膜炎。鸭疫里氏杆菌感染的诊断根据临诊症状和剖检变化可作出初步诊断，但是确诊需要进行微生物学检查。国内外学者还建立了直接荧光抗体法、间接血凝试验、间接免疫荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）[9]、间接免疫酶组织化学法和聚合酶链式反应（PCR）[10]等检测诊断方法。
药物是治疗的预防鸭疫里氏杆菌病的主要措施，但容易产生耐药性，且成本较高。免疫预防是一种经济高效的预防手段，很多国内外学者都在努力研发鸭疫里氏杆菌疫苗[11,12]，但是因为其血清型众多，且各血清型之间的交叉免疫保护作用不确定，所以给疫苗的研发带来很大困难。导致该病目前还是缺乏有效的疫苗。目前，对鸭疫里氏杆菌的研究热点集中在血清型和外膜蛋白A[13]、毒力因子分析等分子生物学研究，以及有效新型疫苗的研发。
1材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株来源 采集疑似病例的组织样品：来自江苏宿迁市某种鹅场。大肠杆菌、葡萄球菌：大学动物医学院传染病实验室4020分离保藏。
1. 1. 2培养基及主要试剂 LB（LuriaBertani）培养基、TSA（Tryptic Soy Agar）培养基、TSB（Tryptic Soy Bro nth）培养基：英国OXOID公司生产。麦康凯培养基：浙江省杭州天和微生物试剂有限公司生产。四季青新生牛血清：浙江天杭生物科技有限公司生产。细菌生化微量发酵管：浙江省杭州天和微生物试剂有限公司生产，常温保存。药敏试纸片：浙江省杭州天和微生物试剂有限公司生产,—4℃保存。
染色剂：革兰氏染色试剂（结晶紫染液、革兰氏碘液、脱色液、沙黄染液）、瑞氏染色试剂（A液、B液）
分子生物学试剂：Taq 2x Master PCR Mix：购自南京天为生物有限公司。引物：上海英骏生物有限公司合成。DNA分子量标准物2000（Mark）、GoldViewⅠ型核酸染色剂：购自Takaba生物科技有限公司。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Keywords 2
引言 3
1材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1 菌株来源 3
1.1.2培养基及主要试剂 3
1.1.3 仪器 4
1.2 方法 4
1.2.1 细菌的分离培养及纯化 4
1.2.2 细菌的染色镜检与增殖纯化培养 4
1.2.3 细菌药敏试验 5
1.2.4 细菌生化试验 5
1.2.5血清型鉴定（玻片凝集试验） 5
1.2.6细菌DNA的PCR扩增 5
1.2.7 琼脂糖凝胶电泳及基因序列测定、同源性比对 6
2 结果 6
2.1 细菌分离培养结果 6
2.2 细菌染色镜检结果 6
2.3细菌药敏试验结果 7
2.4细菌生化试验结果 7
2.5 血清型鉴定结果 7
2.6 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果 8
2.7 PCR产物基因序列测定及同源性比对结果 8
3 分析讨论 9
致谢 9
参考文献 10
附录A 12
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
图1. TSA平板分离的细菌单菌落 6
图2. TSA纯化的分离菌单菌落 6
图3. 革兰氏染色镜检结果 7
图4. 瑞氏染色结果 7
图5. PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果 8
表1. 分离细菌的药敏试验结果 7
表2. 分离细菌的生化试验结果 7
鹅源鸭疫里氏杆菌分离与鉴定
引言
引言
鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌（Riemerella anatipestifer，简称RA）感染导致的急性或慢性、接触性、败血性传染病[1]。鹅的里氏杆菌感染曾被成为鹅流感或鹅渗出性败血症。鸭疫里氏杆菌主要侵害家鸭、家鹅、火鸡和多种家禽和野禽。该病发病率较高，约10—30%[2]，该病广泛分布与世界上多个国家和地区，是目前造成养鸭业、养鹅业经计损失的主要细菌性传染病之一。
鸭疫里氏杆菌曾被称为鸭疫巴氏杆菌，后Rossau等（1991）和Segers（1993）证实，该菌的rRNA与巴氏杆菌属的不同源，与黄杆菌等相近，因此建立里氏杆菌属，归于黄杆菌科[3]。鸭疫里氏杆菌为革兰氏阴性小杆菌，菌体呈杆状或椭圆形，无芽孢，不能运动，有荚膜，经瑞氏染色后，可见两极着色。该菌对营养要求比较高，普通培养基和麦康凯培养基上不生长。初次分离培养需要供给5%—10%的CO2。在TSA或巧克力平板上，生长的菌落无色素，呈圆形、表面光滑，直径1—2mm。鸭疫里氏杆菌不发酵碳水化合物，不分解吲哚、硫化氢和尿素，不还原硝酸盐、靛基质。多液化明胶。鸭疫里氏杆菌的血清型复杂，迄今为止, 国际上确认的血清型共有 21 个，地域分布广泛，最常见的为1、2、3和15型[4]。鸭疫里氏杆菌对青霉素、红霉素、林可霉素、链霉素、氨苄青霉素和新霉素等多种抗生素敏感，对卡那霉素和多粘菌素不敏感，对庆大霉素有一定的抗性[5]。但是近年来随着抗生素的普遍使用、超剂量使用等原因，鸭疫里氏杆菌的抗药性也变得越来越普遍。
鸭疫里氏杆菌对于1—8周龄的鸭、鹅都有侵害性，以往的报道中，鹅的鸭疫里氏杆菌病多见于鸭，近年来，鹅发生鸭疫里氏杆菌病的报道有所增加[68]。急性病例主要见于2—4周龄。鹅感染鸭疫里氏杆菌后，表现为困倦、缩颈，眼与鼻孔有分泌物，不食或少食，腹泻，绿色下痢。濒死前出现神经临诊症状：头颈震颤、角弓反张，尾部摇摆，不久抽搐死亡。病理变化特点为纤维素性心包炎、肝周炎。气囊炎、干酪性输卵管炎和脑膜炎。鸭疫里氏杆菌感染的诊断根据临诊症状和剖检变化可作出初步诊断，但是确诊需要进行微生物学检查。国内外学者还建立了直接荧光抗体法、间接血凝试验、间接免疫荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）[9]、间接免疫酶组织化学法和聚合酶链式反应（PCR）[10]等检测诊断方法。
药物是治疗的预防鸭疫里氏杆菌病的主要措施，但容易产生耐药性，且成本较高。免疫预防是一种经济高效的预防手段，很多国内外学者都在努力研发鸭疫里氏杆菌疫苗[11,12]，但是因为其血清型众多，且各血清型之间的交叉免疫保护作用不确定，所以给疫苗的研发带来很大困难。导致该病目前还是缺乏有效的疫苗。目前，对鸭疫里氏杆菌的研究热点集中在血清型和外膜蛋白A[13]、毒力因子分析等分子生物学研究，以及有效新型疫苗的研发。
1材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株来源 采集疑似病例的组织样品：来自江苏宿迁市某种鹅场。大肠杆菌、葡萄球菌：大学动物医学院传染病实验室4020分离保藏。
1. 1. 2培养基及主要试剂 LB（LuriaBertani）培养基、TSA（Tryptic Soy Agar）培养基、TSB（Tryptic Soy Bro nth）培养基：英国OXOID公司生产。麦康凯培养基：浙江省杭州天和微生物试剂有限公司生产。四季青新生牛血清：浙江天杭生物科技有限公司生产。细菌生化微量发酵管：浙江省杭州天和微生物试剂有限公司生产，常温保存。药敏试纸片：浙江省杭州天和微生物试剂有限公司生产,—4℃保存。
染色剂：革兰氏染色试剂（结晶紫染液、革兰氏碘液、脱色液、沙黄染液）、瑞氏染色试剂（A液、B液）
分子生物学试剂：Taq 2x Master PCR Mix：购自南京天为生物有限公司。引物：上海英骏生物有限公司合成。DNA分子量标准物2000（Mark）、GoldViewⅠ型核酸染色剂：购自Takaba生物科技有限公司。
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