饲喂高精料日粮对山羊瘤胃甲烷菌菌群结构的影响
本文通Real-time PCR和高通量测序技术研究不同日粮条件下山羊瘤胃中甲烷菌菌群结构的差异。试验选用12头装有永久性瘤胃瘘管的山羊，随机分为饲喂全粗料组（Hay; n = 6）和饲喂高精料组（HC,75% 精料；n = 6）。试验持续6 周。结果显示饲喂高精料日粮组山羊瘤胃内容物中总甲烷菌16S rRNA基因拷贝数显著高于全粗料日粮组（P=0.005）。高精料饲喂在种水平上显著改变了山羊瘤胃甲烷菌菌群结构。高精料组中Methanobrevibacter ruminantium clade、Methanosphaera sp. Group5、unclassified Methanosphaera和unclassified Methanobrevibacter 2的比例显著高于全粗料日粮组（P<0.05），而Methanosphaera sp. ISO3-F5、Methanobrevibacter sp. RT、Methanomassiliicoccaceae Group9 sp. ISO4-G1、Methanobrevibacter acididurans、unclassified Methanomassiliicoccaceae和Methanomassiliicoccaceae Group11 sp. ISO4-G11的比例显著低于全粗料日粮组（P<0.05）。结论高精料饲喂改变了山羊瘤胃甲烷菌菌群结构，菌群趋向于适应高精料瘤胃环境。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 主要试剂和仪器 2
1.2 样品来源 2
1.3 DNA提取 2
1.4 Realtime PCR 3
1.5 高通量测序 3
1.6 数据统计 3
2 结果与分析3
2.1高通量测序结果3
2.2 Realtime PCR定量结果3
3 讨论 6
致谢6
参考文献7
图1 种分类水平上的甲烷菌菌群结构4
图2 瘤胃甲烷菌种 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
水平上的主成分分析（PCA）5
表1 高精料饲喂对瘤胃甲烷菌多样性的影响5
表2 高精料饲喂在种水平上对瘤胃甲烷菌的影响5
饲喂高精料日粮对山羊瘤胃甲烷菌菌群结构的影响
动物科学 崔珍珍
引言
引言
甲烷是瘤胃微生物代谢终产物之一，它的产生不仅造成反刍动物饲料能量损失，还会加剧温室效应。反刍动物的甲烷排放量占全球甲烷总排放量的1319%[1]。目前尚没有长期有效的瘤胃甲烷减排策略的一个重要原因就是瘤胃微生物还没有被完全了解，尤其是瘤胃甲烷菌。瘤胃甲烷的产生是一个复杂的生理生化过程，其产生不仅与日粮有关，也与甲烷菌菌群结构有关。
目前关于瘤胃甲烷菌的研究多集中于其多样性。Nicholson等[2]（2007）研究了放牧绵羊和牛瘤胃甲烷菌的多样性，发现宿主对瘤胃甲烷菌多样性的影响不是很强烈。Sundest等[3]（2009）对两个不同地点的驯鹿瘤胃甲烷菌进行了研究，发现其瘤胃甲烷菌多样性与牛和绵羊的大体相同。Jeyanathan等[4]（2011）比较了饲喂不同日粮的牛、山羊和红鹿瘤胃甲烷菌的多样性，发现瘤胃内总古菌区系相对恒定。虽然日粮和宿主能够引起菌群变化，但所有样品都有相同的优势菌群。Franzolin等[5]（2012）研究了不同日粮对水牛瘤胃甲烷菌菌群结构和多样性的影响。在日粮为45%玉米青贮料和55%精料组的甲烷菌克隆库中检测到两个与未分类热原体古菌相关OTU；在日粮为80%甘蔗和20%精料组的甲烷菌克隆库中检测到两个与未分类热原体古菌相关OTU，其中有一个OTU是两组共有的。在日粮为牧草的甲烷菌克隆库中未检测到未分类的热原体古菌OTU。这些研究表明日粮对瘤胃甲烷菌的多样性具有较大影响。山羊养殖在中国是最大的反刍动物养殖产业，但目前关于中国地方山羊瘤胃甲烷菌的研究较少，甲烷菌菌群结构尚不明确。因此，本文通过荧光定量和高通量测序方法研究不同日粮条件下山羊瘤胃甲烷菌菌群结构的变化，旨在为中国山羊甲烷减排提供理论依据。
1.材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
DNA纯化回收试剂盒（TIANGEN）、SYBR Premix Ex Taq 试剂盒（TaKaRa）、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）溶液、酚氯仿异戊醇、PBS溶液（磷酸盐缓冲液）。
离心机（Thermo，LEGEND MICRO 21R,Germany）、水浴锅（数显恒温水浴锅，HH6，中国）、PCR仪（Biometra）、Applied Biosystems 7300 Realtime PCR System（Applied Biosystems，Galifornia，USA）。
1.2样品来源
选取装有永久性瘤胃瘘管的本地公山羊12头（饲养在大学动物房），为了让动物适应低能量日粮，进行为期20天的预饲，任其自由采食全粗料日粮。适应期过后，将其随机分为两组，一组为饲喂全粗料的对照组（Hay, 0%精料，n=6），另一组为饲喂高精料的处理组（HC，75%精料，n=6），自由饮水，单栏饲喂。每天在8:30和17:30将饲料投放在各个饲槽中。在试验之初，每只羊每天限制最大饲喂量为750g。每周对山羊进行称重以调节饲料供应量，计算饲料总量以满足能量和维持基础代谢的营养需要。连续饲喂六周。
六周结束时，早晨饲喂四小时后屠宰，分别取瘤胃内容物，冰盒暂存。瘤胃内容物经匀浆（豆浆机：约30s）、四层纱布过滤后20℃保存以备用。
1.3 DNA提取
瘤胃内容物DNA提取采用CTAB、酚氯仿异戊醇方法。1 mL过滤后的瘤胃液，放入0.3 g锆珠管中。加入PBS涡旋，13000 r离心，每次10 min，直至上清液澄清无色。弃上清，沉淀中加入1 mL CTAB，beadbeat两次，每次2 min，冰上冷却，70℃水浴20 min。离心，弃沉淀，上清转移到2 mL离心管，加入5 μL RNA酶，37℃水浴30 min，取上清。加入酚氯仿异戊醇，振荡，离心，反复抽提，加入异丙醇混匀。过夜，离心，倒出上清。获得灰白色DNA沉淀。加入500uL 70%的冷乙醇，将白色沉淀轻轻弹起。在13000rpm条件下离心1015 min，倒出上清，风干DNA。加入50100uL的TE buffer（视沉淀体积而定），在70℃条件下放置5 min。用Nanodrop测定DNA的浓度。
1.4 Realtime PCR
总甲烷菌定量引物如下（Jeyanathan等，2011）：PCR产物长度约471bp，915f 5’AAG AAT TGG CGG GG AGC AC;1386r 5’GCG GTG TGT GCA AGG AGC。反应程序：95℃，30 s；接40个循环95℃，5 s；59℃，30 s；72℃，30 s。
标准曲线由引物的PCR产物制作的质粒制成。
1.5高通量测序
本文采用MiSeq PE300测序平台测序。甲烷菌测序引物采用915f/1386r（Jeyanathan等，2011）。数据分析采用UPARSE软件。参考数据库采用RIMDB数据库（Seedford 等，2014）。将质控之后的优化序列与OTU中的序列比较，根据97%的相似性将优化序列归并到相关OTU 中。在基于 OTU 划分的基础上，使用指数 Chao 和 Ace 计算菌群丰度，使用指数Shannon计算菌群多样性，使用 Coverage 计算测序覆盖率。本研究高通量测序部分由上海天昊生物科技有限公司提供技术支持。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 主要试剂和仪器 2
1.2 样品来源 2
1.3 DNA提取 2
1.4 Realtime PCR 3
1.5 高通量测序 3
1.6 数据统计 3
2 结果与分析3
2.1高通量测序结果3
2.2 Realtime PCR定量结果3
3 讨论 6
致谢6
参考文献7
图1 种分类水平上的甲烷菌菌群结构4
图2 瘤胃甲烷菌种 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
水平上的主成分分析（PCA）5
表1 高精料饲喂对瘤胃甲烷菌多样性的影响5
表2 高精料饲喂在种水平上对瘤胃甲烷菌的影响5
饲喂高精料日粮对山羊瘤胃甲烷菌菌群结构的影响
动物科学 崔珍珍
引言
引言
甲烷是瘤胃微生物代谢终产物之一，它的产生不仅造成反刍动物饲料能量损失，还会加剧温室效应。反刍动物的甲烷排放量占全球甲烷总排放量的1319%[1]。目前尚没有长期有效的瘤胃甲烷减排策略的一个重要原因就是瘤胃微生物还没有被完全了解，尤其是瘤胃甲烷菌。瘤胃甲烷的产生是一个复杂的生理生化过程，其产生不仅与日粮有关，也与甲烷菌菌群结构有关。
目前关于瘤胃甲烷菌的研究多集中于其多样性。Nicholson等[2]（2007）研究了放牧绵羊和牛瘤胃甲烷菌的多样性，发现宿主对瘤胃甲烷菌多样性的影响不是很强烈。Sundest等[3]（2009）对两个不同地点的驯鹿瘤胃甲烷菌进行了研究，发现其瘤胃甲烷菌多样性与牛和绵羊的大体相同。Jeyanathan等[4]（2011）比较了饲喂不同日粮的牛、山羊和红鹿瘤胃甲烷菌的多样性，发现瘤胃内总古菌区系相对恒定。虽然日粮和宿主能够引起菌群变化，但所有样品都有相同的优势菌群。Franzolin等[5]（2012）研究了不同日粮对水牛瘤胃甲烷菌菌群结构和多样性的影响。在日粮为45%玉米青贮料和55%精料组的甲烷菌克隆库中检测到两个与未分类热原体古菌相关OTU；在日粮为80%甘蔗和20%精料组的甲烷菌克隆库中检测到两个与未分类热原体古菌相关OTU，其中有一个OTU是两组共有的。在日粮为牧草的甲烷菌克隆库中未检测到未分类的热原体古菌OTU。这些研究表明日粮对瘤胃甲烷菌的多样性具有较大影响。山羊养殖在中国是最大的反刍动物养殖产业，但目前关于中国地方山羊瘤胃甲烷菌的研究较少，甲烷菌菌群结构尚不明确。因此，本文通过荧光定量和高通量测序方法研究不同日粮条件下山羊瘤胃甲烷菌菌群结构的变化，旨在为中国山羊甲烷减排提供理论依据。
1.材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
DNA纯化回收试剂盒（TIANGEN）、SYBR Premix Ex Taq 试剂盒（TaKaRa）、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）溶液、酚氯仿异戊醇、PBS溶液（磷酸盐缓冲液）。
离心机（Thermo，LEGEND MICRO 21R,Germany）、水浴锅（数显恒温水浴锅，HH6，中国）、PCR仪（Biometra）、Applied Biosystems 7300 Realtime PCR System（Applied Biosystems，Galifornia，USA）。
1.2样品来源
选取装有永久性瘤胃瘘管的本地公山羊12头（饲养在大学动物房），为了让动物适应低能量日粮，进行为期20天的预饲，任其自由采食全粗料日粮。适应期过后，将其随机分为两组，一组为饲喂全粗料的对照组（Hay, 0%精料，n=6），另一组为饲喂高精料的处理组（HC，75%精料，n=6），自由饮水，单栏饲喂。每天在8:30和17:30将饲料投放在各个饲槽中。在试验之初，每只羊每天限制最大饲喂量为750g。每周对山羊进行称重以调节饲料供应量，计算饲料总量以满足能量和维持基础代谢的营养需要。连续饲喂六周。
六周结束时，早晨饲喂四小时后屠宰，分别取瘤胃内容物，冰盒暂存。瘤胃内容物经匀浆（豆浆机：约30s）、四层纱布过滤后20℃保存以备用。
1.3 DNA提取
瘤胃内容物DNA提取采用CTAB、酚氯仿异戊醇方法。1 mL过滤后的瘤胃液，放入0.3 g锆珠管中。加入PBS涡旋，13000 r离心，每次10 min，直至上清液澄清无色。弃上清，沉淀中加入1 mL CTAB，beadbeat两次，每次2 min，冰上冷却，70℃水浴20 min。离心，弃沉淀，上清转移到2 mL离心管，加入5 μL RNA酶，37℃水浴30 min，取上清。加入酚氯仿异戊醇，振荡，离心，反复抽提，加入异丙醇混匀。过夜，离心，倒出上清。获得灰白色DNA沉淀。加入500uL 70%的冷乙醇，将白色沉淀轻轻弹起。在13000rpm条件下离心1015 min，倒出上清，风干DNA。加入50100uL的TE buffer（视沉淀体积而定），在70℃条件下放置5 min。用Nanodrop测定DNA的浓度。
1.4 Realtime PCR
总甲烷菌定量引物如下（Jeyanathan等，2011）：PCR产物长度约471bp，915f 5’AAG AAT TGG CGG GG AGC AC;1386r 5’GCG GTG TGT GCA AGG AGC。反应程序：95℃，30 s；接40个循环95℃，5 s；59℃，30 s；72℃，30 s。
标准曲线由引物的PCR产物制作的质粒制成。
1.5高通量测序
本文采用MiSeq PE300测序平台测序。甲烷菌测序引物采用915f/1386r（Jeyanathan等，2011）。数据分析采用UPARSE软件。参考数据库采用RIMDB数据库（Seedford 等，2014）。将质控之后的优化序列与OTU中的序列比较，根据97%的相似性将优化序列归并到相关OTU 中。在基于 OTU 划分的基础上，使用指数 Chao 和 Ace 计算菌群丰度，使用指数Shannon计算菌群多样性，使用 Coverage 计算测序覆盖率。本研究高通量测序部分由上海天昊生物科技有限公司提供技术支持。
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