攀枝花市猪肉中呋喃唑酮及其代谢物的调查
攀枝花市猪肉中呋喃唑酮及其代谢物的调查[20200507185838]
摘要：为检测攀枝花市猪肉中呋喃唑酮及其代谢物残留量，抽取40份猪肉样品进行检查。检测方法分为胶体金试纸条快速检测筛选法以及酶联免疫法进行复合检测，胶体金试纸条法能快速检测，但精确度不高且容易因其他因素影响导致偏差，酶联免疫法能够准确检测出呋喃唑酮及其代谢物。试验结果表明攀枝花市猪肉质量安全。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
关键字:呋喃唑酮；胶体金试纸条；酶联免疫法
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
1 材料与方法 2
1.1 试验样品来源 2
1.2主要仪器和试剂2
1.2.1主要仪器2
1.2.2试剂3
1.3 样品检测方法 3
1.3.1 胶体金试纸条法3
1.3.2 酶联免疫法3
1.3.2.1 提取3
1.3.2.2 测定3
1.4 结果计算3
2 结果与分析3
2.1胶体金试纸条检测法结果3
2.2 酶联免疫法检测结果4
3 讨论5
致谢6
参考文献6
攀枝花市猪肉中呋喃唑酮及其代谢物的调查
引言
硝基呋喃类药物是一种化学合成的广谱抗菌药，水产养殖业已禁止使用，但因其低廉高效，加之使用者、经营者对其毒性和危害认识不足，屡禁不止，多次引发重大事故，经济损失惨重[1]。为了预防和治疗家畜和养殖鱼患病而大量投入抗生素等化学药物往往造成药物残留于食品动物组织中伴随而来的是对公众健康和环境的影响[2]。由于硝基呋喃类药物在体内很快就能被代谢，而在组织中蛋白结合态的代谢产物则能存留较长的一段时间，所以在分析此类药物的残留时经常要分析其代谢后的产物，管理部门就以检测代谢产物为手段达到检测硝基呋喃类残留的目的[3]。
1 材料与方法
1.1 试验样品来源
攀枝花市农贸市场及超市新鲜猪肉，每周取10份样品，每份为0.25 kg左右，持续4周，以达到调查目的。
1.2 主要仪器和试剂
1.2.1 主要仪器
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
> 电子秤，微量移液器，多道移液器，均质器，水浴锅，恒温培养箱，AllegraTM21R 台式高速冷冻离心机（美国Beckman 公司），NEVAP-11155 氮吹仪（Supleco），酶标仪，离心管等。
1.2.2 试剂
5 mol/L盐酸溶液，1 mol/L氢氧化钠溶液，5 mmol/L三羟甲基氨甲烷溶液，磷酸氢二钾溶液, 磷酸盐缓冲液,标准溶液，抗体，酶标记抗体，衍生液，乙酸乙酯，浓缩样本稀释液，呋喃唑酮残留标示物检测试剂盒材料，呋喃唑酮代谢物快速检测试剂盒等。
1.3 样品检测方法
1.3.1 胶体金试纸条法
①将每周取到的新鲜猪肉样品10份用均质器处理，取3.0±0.05 g均质样本至15 mL离心管中，依次加入4 mL蒸馏水、0.5 mL三氯乙酸和0.6 mL衍生化试剂，振荡混匀，65 ℃水浴中孵育30 min。
②依次加入1 mL磷酸氢二钾溶液、0.4 mL氢氧化钠溶液和4 mL乙酸乙酯，振荡混匀。
③室温下（20 ℃～25 ℃）4000 r/min离心5 min，去2 mL上层乙酸乙酯相至5 mL离心管中，在50 ℃～60 ℃水浴中用氮气吹干。
④取1 mL正己烷溶解干燥物，加入0.5 ml磷酸盐缓冲液振荡混匀，在室温下（20 ℃～25 ℃）4000 r/min离心2 min，待检。
1.3.2 酶联免疫法
1.3.2.1 提取
称取样品1.00±0.01 g于10 mL离心管中，加入三羟甲基氨甲烷溶液 3 mL，涡旋30 s，于60 ℃恒温水浴锅孵育3 h，冷却至室温，加入盐酸溶液150 μL和衍生液150 μL，充分振荡，置37 ℃恒温水浴锅孵育12 h，冷却至室温，加入提取液360 μL，涡旋30 s。用氢氧化钠溶液调pH至7.0±0.2， 5000 r/min 4 ℃离心20 min。上清液移至另一容器，做为试样溶液，供ELISA方法测定。
1.3.2.2 测定
将若干孔条插入微孔架，依次向微孔中加入标准溶液或试样溶液60 μL/孔，加入抗体工作液40 μL/孔，充分混匀后，置于盒中，37 ℃恒温箱孵育1 h，弃去孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体，加入洗涤液200 μL/孔，弃去孔内液体，再将酶标板倒置在吸水纸上拍打，重复洗板3次，加入酶标抗体工作液100 μL/孔，置于盒中，37 ℃恒温箱孵育1 h，按上述方法洗板5次，加入底物液100 μL/孔，置于盒中，37 ℃恒温箱孵育15～20 min，加入终止液50 μL/孔，在450 nm处用酶标仪测量吸光度（OD）值，在加入终止液后60 min内读取吸光值。
1.4 结果计算
按公式计算百分吸光度值：
百分吸光度值= ×100%（B——标准溶液或样品的平均吸光度值；Bo——零浓度标准溶液平均吸光度值）。
2 结果与分析
2.1 胶体金试纸条检测法结果
共检测40份样品，检测结果中除第二组（图1）中23号检出为假阳性（酶联免疫检测未检出），其余样品中呋喃唑酮及其残留物含量均合格（双红线）。
图1 胶体金试纸条检测法结果
Fig. 1 Detected re *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
sults of colloidal gold test strip
2.2 酶联免疫法检测结果
对40份猪肉样品进行酶联免疫法检测，并计算出百分度吸光值（表2），再与计算表（表1）比较并计算出呋喃唑酮代谢物标准品浓度（ppb）值，
表1 计算表
Table 1 Related calculation results
Ppb Repeat 1 Repeat 2 Average CV% B/Bo% Diff. Calculate Recovery%
0 0.481 0.530 0.506 6.85 100.00 0.000
0.025 0.170 0.289 0.230 36.66 45.40 54.60 0.018 70.1
0.075 0.171 0.132 0.152 18.20 29.97 15.43 0.082 108.7
0.225 0.065 0.063 0.063 2.21 12.66 17.31 0.457 203.3
0.675 0.071 0.043 0.057 34.74 11.28 1.38 0.525 77.8
2.025 -0.001 -0.003 (0.002) -70.71 -0.40 11.67 1.679 82.9
表2 酶联免疫法检测结果检测结果
Table 2 Detected results of enzyme linked immunosorbent assay
编号 吸光值1 吸光值2 平均值 CV% B/Bo% 计算值ppb 稀释倍数 可测最低浓度ppb 阀值ppb 结果值ppb 判定
01 0.370 0.295 0.333 15.95 65.78 0.002 2 0.100 100.00 0.005 未检出
优良（30—21分） 一般（20—11分） 较差（10—0分）
摘要：为检测攀枝花市猪肉中呋喃唑酮及其代谢物残留量，抽取40份猪肉样品进行检查。检测方法分为胶体金试纸条快速检测筛选法以及酶联免疫法进行复合检测，胶体金试纸条法能快速检测，但精确度不高且容易因其他因素影响导致偏差，酶联免疫法能够准确检测出呋喃唑酮及其代谢物。试验结果表明攀枝花市猪肉质量安全。
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关键字:呋喃唑酮；胶体金试纸条；酶联免疫法
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
1 材料与方法 2
1.1 试验样品来源 2
1.2主要仪器和试剂2
1.2.1主要仪器2
1.2.2试剂3
1.3 样品检测方法 3
1.3.1 胶体金试纸条法3
1.3.2 酶联免疫法3
1.3.2.1 提取3
1.3.2.2 测定3
1.4 结果计算3
2 结果与分析3
2.1胶体金试纸条检测法结果3
2.2 酶联免疫法检测结果4
3 讨论5
致谢6
参考文献6
攀枝花市猪肉中呋喃唑酮及其代谢物的调查
引言
硝基呋喃类药物是一种化学合成的广谱抗菌药，水产养殖业已禁止使用，但因其低廉高效，加之使用者、经营者对其毒性和危害认识不足，屡禁不止，多次引发重大事故，经济损失惨重[1]。为了预防和治疗家畜和养殖鱼患病而大量投入抗生素等化学药物往往造成药物残留于食品动物组织中伴随而来的是对公众健康和环境的影响[2]。由于硝基呋喃类药物在体内很快就能被代谢，而在组织中蛋白结合态的代谢产物则能存留较长的一段时间，所以在分析此类药物的残留时经常要分析其代谢后的产物，管理部门就以检测代谢产物为手段达到检测硝基呋喃类残留的目的[3]。
1 材料与方法
1.1 试验样品来源
攀枝花市农贸市场及超市新鲜猪肉，每周取10份样品，每份为0.25 kg左右，持续4周，以达到调查目的。
1.2 主要仪器和试剂
1.2.1 主要仪器
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
> 电子秤，微量移液器，多道移液器，均质器，水浴锅，恒温培养箱，AllegraTM21R 台式高速冷冻离心机（美国Beckman 公司），NEVAP-11155 氮吹仪（Supleco），酶标仪，离心管等。
1.2.2 试剂
5 mol/L盐酸溶液，1 mol/L氢氧化钠溶液，5 mmol/L三羟甲基氨甲烷溶液，磷酸氢二钾溶液, 磷酸盐缓冲液,标准溶液，抗体，酶标记抗体，衍生液，乙酸乙酯，浓缩样本稀释液，呋喃唑酮残留标示物检测试剂盒材料，呋喃唑酮代谢物快速检测试剂盒等。
1.3 样品检测方法
1.3.1 胶体金试纸条法
①将每周取到的新鲜猪肉样品10份用均质器处理，取3.0±0.05 g均质样本至15 mL离心管中，依次加入4 mL蒸馏水、0.5 mL三氯乙酸和0.6 mL衍生化试剂，振荡混匀，65 ℃水浴中孵育30 min。
②依次加入1 mL磷酸氢二钾溶液、0.4 mL氢氧化钠溶液和4 mL乙酸乙酯，振荡混匀。
③室温下（20 ℃～25 ℃）4000 r/min离心5 min，去2 mL上层乙酸乙酯相至5 mL离心管中，在50 ℃～60 ℃水浴中用氮气吹干。
④取1 mL正己烷溶解干燥物，加入0.5 ml磷酸盐缓冲液振荡混匀，在室温下（20 ℃～25 ℃）4000 r/min离心2 min，待检。
1.3.2 酶联免疫法
1.3.2.1 提取
称取样品1.00±0.01 g于10 mL离心管中，加入三羟甲基氨甲烷溶液 3 mL，涡旋30 s，于60 ℃恒温水浴锅孵育3 h，冷却至室温，加入盐酸溶液150 μL和衍生液150 μL，充分振荡，置37 ℃恒温水浴锅孵育12 h，冷却至室温，加入提取液360 μL，涡旋30 s。用氢氧化钠溶液调pH至7.0±0.2， 5000 r/min 4 ℃离心20 min。上清液移至另一容器，做为试样溶液，供ELISA方法测定。
1.3.2.2 测定
将若干孔条插入微孔架，依次向微孔中加入标准溶液或试样溶液60 μL/孔，加入抗体工作液40 μL/孔，充分混匀后，置于盒中，37 ℃恒温箱孵育1 h，弃去孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体，加入洗涤液200 μL/孔，弃去孔内液体，再将酶标板倒置在吸水纸上拍打，重复洗板3次，加入酶标抗体工作液100 μL/孔，置于盒中，37 ℃恒温箱孵育1 h，按上述方法洗板5次，加入底物液100 μL/孔，置于盒中，37 ℃恒温箱孵育15～20 min，加入终止液50 μL/孔，在450 nm处用酶标仪测量吸光度（OD）值，在加入终止液后60 min内读取吸光值。
1.4 结果计算
按公式计算百分吸光度值：
百分吸光度值= ×100%（B——标准溶液或样品的平均吸光度值；Bo——零浓度标准溶液平均吸光度值）。
2 结果与分析
2.1 胶体金试纸条检测法结果
共检测40份样品，检测结果中除第二组（图1）中23号检出为假阳性（酶联免疫检测未检出），其余样品中呋喃唑酮及其残留物含量均合格（双红线）。
图1 胶体金试纸条检测法结果
Fig. 1 Detected re *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
sults of colloidal gold test strip
2.2 酶联免疫法检测结果
对40份猪肉样品进行酶联免疫法检测，并计算出百分度吸光值（表2），再与计算表（表1）比较并计算出呋喃唑酮代谢物标准品浓度（ppb）值，
表1 计算表
Table 1 Related calculation results
Ppb Repeat 1 Repeat 2 Average CV% B/Bo% Diff. Calculate Recovery%
0 0.481 0.530 0.506 6.85 100.00 0.000
0.025 0.170 0.289 0.230 36.66 45.40 54.60 0.018 70.1
0.075 0.171 0.132 0.152 18.20 29.97 15.43 0.082 108.7
0.225 0.065 0.063 0.063 2.21 12.66 17.31 0.457 203.3
0.675 0.071 0.043 0.057 34.74 11.28 1.38 0.525 77.8
2.025 -0.001 -0.003 (0.002) -70.71 -0.40 11.67 1.679 82.9
表2 酶联免疫法检测结果检测结果
Table 2 Detected results of enzyme linked immunosorbent assay
编号 吸光值1 吸光值2 平均值 CV% B/Bo% 计算值ppb 稀释倍数 可测最低浓度ppb 阀值ppb 结果值ppb 判定
01 0.370 0.295 0.333 15.95 65.78 0.002 2 0.100 100.00 0.005 未检出
优良（30—21分） 一般（20—11分） 较差（10—0分）
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