二花脸猪产仔水平离散度分析及后备猪选留建议
二花脸猪产仔水平离散度分析及后备猪选留建议[20200510205646]
摘要：【目的】试验通过根据已经成功牛的胚胎孵化后的体外培养系统来模拟建立一个猪胚胎孵化后体外培养系统。通过调整血清和葡萄糖的浓度，并加入一些子宫内的生长因子，来调整猪胚胎孵化后的体外培养体系。【方法】制作玻璃“梳子”在琼脂糖凝胶中打孔，并加入培养液，等胚胎发育到第7天时选择已经孵化并且形态好的囊胚，分别放入每个孔中，将整个胚胎培养系统放入培养箱中，每天拍照观察，并对结果做统计分析【结果】孵化后的胚胎在孔中有生长，膨大的迹象，一般能生长三天，好的能生长的四天。【结论】孔中培养确实能使胚胎继续生长，并且葡萄糖对于胚胎的生长有促进作用。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:猪；胚胎；孵化；培养体系
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 2
引言2
1 材料与方法 2
1．1 卵的采集，卵母细胞体外成熟，孤雌激活，胚胎发育2
1.1.1采卵，体外成熟2
1.1.2消化透明带，孤雌激活2
1．2 制胶打孔为胚胎孵化后的发育提供场所2
1.2.1 “梳子”的准备2
1.2.2 制胶打孔2
1. 3 将孵化后的胚胎移入准备好的胶孔中3
2 结果与分析 3
2.1 实验结果3
2.2 结果分析 4
2.2.1 制胶打孔的探索 4
2.2.2培养液的探索4
2.2.3 胚胎孵化方面的探索4
3 讨论 6
3．1 培养液的调整4
3．2 琼脂糖凝胶孔孔径的调整6
3.3 胚胎的孵化6
3.4下一步的探索方向 6
致谢7
参考文献7
表 一2
表 二3
图 12
图22
图 32
图43
图 5 3
图63
图74
图 84
图 94
图105
图 115
图 125
图 135
图 145
图 155
图 165
猪胚胎孵化后体外培养体系的建立
引言
引言
目前，尽管胚胎体外发 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
育到囊胚，并进行胚胎移植这种技术的效率已经有了很大的提高，但这种技术产生的新生胎儿仍旧存在很多的问题，比如，早期胚胎或胎儿死亡[1,2]，胎儿异常，高出生重，胎盘变形[3,4]等。而现在评价胚胎发育潜力的方式大致可以两种，一种是评价囊胚质量，另一种就是根据胚胎在受体中的发育参数来评价。但这两种方法都不够精细，并且很昂贵，所以我们需要一种更加精确并且实用的方式来评价胚胎的质量，从而对胚胎的健康发育提供更好的保证。建立猪囊胚孵化后体外培养体系可以对支持更高级的发育提供很大的帮助，通过比较胚胎在这个程序中的发育潜力，可以对各种培养和操作胚胎的系统价值进行一个评价，也是一种具有很高预测价值的系统。有助于推进各种方法最优化的进程，这将会为研究胚胎发育机制提供一种新的可能。
早期，虽然科学家尝试体外培养小鼠和大鼠囊胚后胚胎，并体外发育几天到外胚层分化期，但大部分胚胎都凋亡并只有个别细胞能够发育[5,6],而最成功的则要归功于丹麦Vajta所带领的团队，把牛的孵化后囊胚成功体外培养到16天，并对该时期胚胎的形态及滋养层与内细胞团细胞的分化进行了初步观测分析[7，8，9]。本实验将会结合丹麦Vajta团队在牛胚胎孵化后体外培养系统成功建立的基础上，探索猪胚胎孵化后体外培养系统，并进一步分析在这期间不同时期胚胎的转录、表观、及分化机制。
1 材料与方法
1．1 卵的采集，卵母细胞体外成熟，孤雌激活，胚胎发育
从南京某固定屠宰场采集卵巢，采集卵子后在成熟培养液中培养44h后，在体视显微镜下选取排出第一极体的卵母细胞，通过孤雌激活让卵母细胞发育成囊胚，当猪胚胎发育到第7-8天时选择已经孵化的囊胚放入提前准备好的琼脂糖凝胶孔中继续培养。
1.1. 1采卵，体外成熟
从屠宰场采集的卵巢放在保温杯中1h，温度为32℃,然后用提前在35℃的水浴锅中预热的500ml生理盐水缓冲液冲洗卵巢，生理盐水中提前分别加入链霉素（10万U/ml）和青霉素（10万U/ml）各1ml混匀，，选取发育健康正常的卵巢，用20ml的注射器抽吸卵巢上发育良好的卵泡，每次将抽吸的卵泡液打入10ml的离心管中，待离心管打满后计时10分钟,10分钟后抽调10ml离心管中的上清液，留2ml沉淀液。在沉淀液中加入4ml的洗卵液（ASP）,混匀，将混合液倒入培养皿中，在立体显微镜下挑选颗粒细胞完整的卵子（一般有3-4层的颗粒细胞为最佳），将卵子培养在四孔板中，培养液为：400ul碳酸氢盐缓冲的TM199+10%的牛血清+15IU/ml孕马血清促性腺激素+15IU/ml人绒毛膜促性腺激素，覆盖石蜡油，培养在38.5℃，5%CO2 ，5%O2 ，90%N2 ,100%H2O的环境中，每60个卵子放一个孔，培养44h。
1．1．2 消化透明带，孤雌激活
将已经培养44h的卵从培养箱中取出，在透明质酸酶（Hya，0.1 mol/l）中吹打100下消化颗粒细胞，再用T2（TM199+2%血清（CS））洗3次，在体视显微镜下挑选已经排出第一极体的卵母细胞，将这些排出第一极体的卵母细胞消化透明带，消化酶为QZ（Pronase: FBS=200: 200），将卵母细胞放入酶中并在立体显微镜下观察，当看到透明带已经消化完后，立即将卵从酶中取出并分别在T2,T20（TM199+20%CS），T2中洗一次。然后后进行 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
电激活，激活液为F+（mannitol and PVA + 1% MgSO4 + 1% GaClH2O），激活的参数为，63V，80，3，激活后将这些卵母细胞再PZM-3中洗一次之后放入化学激活盘中进行化学激活4h，化学激活液为PCC（PZM3：CX（细胞松弛素，5ug/ml）:CB（放线菌酮，10ug/ml）=1000：10：1），4h后将胚胎移入四孔板中，培养液为PZM-3。
1．2 制胶打孔为胚胎孵化后的发育提供场所
1．2．1 “梳子”的准备。
将规格为2.5um×2.0um×150mm的毛细管在酒精灯火焰上融化拉细，拉出直径为1.2um的细管，截取成30umcm长粗细均匀的玻璃细管，如图2，截取6段，每个玻璃细管的一端在酒精灯上融化封闭，另一端粘在泡棉胶上，伸出泡棉胶的长度为1.5cm，每两个玻璃管的间距为0.5cm，如图1，制好的“梳子”在超净台照紫外15min备用。
1. 2. 2 制胶打孔。
在超净台上，往培养皿（35mm×10mm）中加入1000ul的凝胶（3%低熔点琼脂+PBS（Ca2+ , Mg2+ ）在微波炉中先中火2min再中高火2min融化），将制好的“梳子”倾斜放入胶中，“梳子”的低端玻璃细管接触到培养皿的底，“梳子”的上端泡棉胶靠在培养皿的边缘，将整个培养皿放在冰袋上，加快胶的凝固，同时防止水分过多蒸发，待胶凝固后轻轻拔出梳子，在超净台照射紫外15min后加入1000ul MPZM-3液（未加BSA的PZM-3+10%FBS+3g/L葡萄糖）。制好的胶盘在培养箱中平衡3天，每天换液，并用比胶孔孔径小的口吸管每天用mPZM-3冲洗胶孔确保胶孔中没有气泡，胶孔已被培养液充分浸透，第三次换液后盖上石蜡油，如图3。将整个培养盘称作Post Hatching Development PHD（Post Hatching Development）培养盘。
1. 3 将孵化后的胚胎移入准备好的胶孔中
3．1 培养液的调整
从我们目前掌握的实验结果来看，胚胎在放入培养液中存在“复苏”现象，这充分说明葡萄糖对胚胎的快速生长起到了促进作用。但胚胎在发育过程中存在复杂的代谢过程，比如产物和有害物质，比如氨，氧根等的积累，这些都是有可能发生的。[18]同时，除了葡萄糖，我们并没有尝试其他的营养物质，也许会有更好的营养物质的存在。对于葡萄糖浓度，其实并不是越高越好，同时葡萄糖在胚胎发育的早期是由不利影响的。在牛方面，已经有实验证明FBS的浓度越高，胚胎的发育效果越好，[9]可能是由于FSA中有许多未知的生长因子，同时，FBS对胚胎也许起到的物理方面的作用，但这个并没有被探明。
摘要：【目的】试验通过根据已经成功牛的胚胎孵化后的体外培养系统来模拟建立一个猪胚胎孵化后体外培养系统。通过调整血清和葡萄糖的浓度，并加入一些子宫内的生长因子，来调整猪胚胎孵化后的体外培养体系。【方法】制作玻璃“梳子”在琼脂糖凝胶中打孔，并加入培养液，等胚胎发育到第7天时选择已经孵化并且形态好的囊胚，分别放入每个孔中，将整个胚胎培养系统放入培养箱中，每天拍照观察，并对结果做统计分析【结果】孵化后的胚胎在孔中有生长，膨大的迹象，一般能生长三天，好的能生长的四天。【结论】孔中培养确实能使胚胎继续生长，并且葡萄糖对于胚胎的生长有促进作用。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:猪；胚胎；孵化；培养体系
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 2
引言2
1 材料与方法 2
1．1 卵的采集，卵母细胞体外成熟，孤雌激活，胚胎发育2
1.1.1采卵，体外成熟2
1.1.2消化透明带，孤雌激活2
1．2 制胶打孔为胚胎孵化后的发育提供场所2
1.2.1 “梳子”的准备2
1.2.2 制胶打孔2
1. 3 将孵化后的胚胎移入准备好的胶孔中3
2 结果与分析 3
2.1 实验结果3
2.2 结果分析 4
2.2.1 制胶打孔的探索 4
2.2.2培养液的探索4
2.2.3 胚胎孵化方面的探索4
3 讨论 6
3．1 培养液的调整4
3．2 琼脂糖凝胶孔孔径的调整6
3.3 胚胎的孵化6
3.4下一步的探索方向 6
致谢7
参考文献7
表 一2
表 二3
图 12
图22
图 32
图43
图 5 3
图63
图74
图 84
图 94
图105
图 115
图 125
图 135
图 145
图 155
图 165
猪胚胎孵化后体外培养体系的建立
引言
引言
目前，尽管胚胎体外发 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
育到囊胚，并进行胚胎移植这种技术的效率已经有了很大的提高，但这种技术产生的新生胎儿仍旧存在很多的问题，比如，早期胚胎或胎儿死亡[1,2]，胎儿异常，高出生重，胎盘变形[3,4]等。而现在评价胚胎发育潜力的方式大致可以两种，一种是评价囊胚质量，另一种就是根据胚胎在受体中的发育参数来评价。但这两种方法都不够精细，并且很昂贵，所以我们需要一种更加精确并且实用的方式来评价胚胎的质量，从而对胚胎的健康发育提供更好的保证。建立猪囊胚孵化后体外培养体系可以对支持更高级的发育提供很大的帮助，通过比较胚胎在这个程序中的发育潜力，可以对各种培养和操作胚胎的系统价值进行一个评价，也是一种具有很高预测价值的系统。有助于推进各种方法最优化的进程，这将会为研究胚胎发育机制提供一种新的可能。
早期，虽然科学家尝试体外培养小鼠和大鼠囊胚后胚胎，并体外发育几天到外胚层分化期，但大部分胚胎都凋亡并只有个别细胞能够发育[5,6],而最成功的则要归功于丹麦Vajta所带领的团队，把牛的孵化后囊胚成功体外培养到16天，并对该时期胚胎的形态及滋养层与内细胞团细胞的分化进行了初步观测分析[7，8，9]。本实验将会结合丹麦Vajta团队在牛胚胎孵化后体外培养系统成功建立的基础上，探索猪胚胎孵化后体外培养系统，并进一步分析在这期间不同时期胚胎的转录、表观、及分化机制。
1 材料与方法
1．1 卵的采集，卵母细胞体外成熟，孤雌激活，胚胎发育
从南京某固定屠宰场采集卵巢，采集卵子后在成熟培养液中培养44h后，在体视显微镜下选取排出第一极体的卵母细胞，通过孤雌激活让卵母细胞发育成囊胚，当猪胚胎发育到第7-8天时选择已经孵化的囊胚放入提前准备好的琼脂糖凝胶孔中继续培养。
1.1. 1采卵，体外成熟
从屠宰场采集的卵巢放在保温杯中1h，温度为32℃,然后用提前在35℃的水浴锅中预热的500ml生理盐水缓冲液冲洗卵巢，生理盐水中提前分别加入链霉素（10万U/ml）和青霉素（10万U/ml）各1ml混匀，，选取发育健康正常的卵巢，用20ml的注射器抽吸卵巢上发育良好的卵泡，每次将抽吸的卵泡液打入10ml的离心管中，待离心管打满后计时10分钟,10分钟后抽调10ml离心管中的上清液，留2ml沉淀液。在沉淀液中加入4ml的洗卵液（ASP）,混匀，将混合液倒入培养皿中，在立体显微镜下挑选颗粒细胞完整的卵子（一般有3-4层的颗粒细胞为最佳），将卵子培养在四孔板中，培养液为：400ul碳酸氢盐缓冲的TM199+10%的牛血清+15IU/ml孕马血清促性腺激素+15IU/ml人绒毛膜促性腺激素，覆盖石蜡油，培养在38.5℃，5%CO2 ，5%O2 ，90%N2 ,100%H2O的环境中，每60个卵子放一个孔，培养44h。
1．1．2 消化透明带，孤雌激活
将已经培养44h的卵从培养箱中取出，在透明质酸酶（Hya，0.1 mol/l）中吹打100下消化颗粒细胞，再用T2（TM199+2%血清（CS））洗3次，在体视显微镜下挑选已经排出第一极体的卵母细胞，将这些排出第一极体的卵母细胞消化透明带，消化酶为QZ（Pronase: FBS=200: 200），将卵母细胞放入酶中并在立体显微镜下观察，当看到透明带已经消化完后，立即将卵从酶中取出并分别在T2,T20（TM199+20%CS），T2中洗一次。然后后进行 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
电激活，激活液为F+（mannitol and PVA + 1% MgSO4 + 1% GaClH2O），激活的参数为，63V，80，3，激活后将这些卵母细胞再PZM-3中洗一次之后放入化学激活盘中进行化学激活4h，化学激活液为PCC（PZM3：CX（细胞松弛素，5ug/ml）:CB（放线菌酮，10ug/ml）=1000：10：1），4h后将胚胎移入四孔板中，培养液为PZM-3。
1．2 制胶打孔为胚胎孵化后的发育提供场所
1．2．1 “梳子”的准备。
将规格为2.5um×2.0um×150mm的毛细管在酒精灯火焰上融化拉细，拉出直径为1.2um的细管，截取成30umcm长粗细均匀的玻璃细管，如图2，截取6段，每个玻璃细管的一端在酒精灯上融化封闭，另一端粘在泡棉胶上，伸出泡棉胶的长度为1.5cm，每两个玻璃管的间距为0.5cm，如图1，制好的“梳子”在超净台照紫外15min备用。
1. 2. 2 制胶打孔。
在超净台上，往培养皿（35mm×10mm）中加入1000ul的凝胶（3%低熔点琼脂+PBS（Ca2+ , Mg2+ ）在微波炉中先中火2min再中高火2min融化），将制好的“梳子”倾斜放入胶中，“梳子”的低端玻璃细管接触到培养皿的底，“梳子”的上端泡棉胶靠在培养皿的边缘，将整个培养皿放在冰袋上，加快胶的凝固，同时防止水分过多蒸发，待胶凝固后轻轻拔出梳子，在超净台照射紫外15min后加入1000ul MPZM-3液（未加BSA的PZM-3+10%FBS+3g/L葡萄糖）。制好的胶盘在培养箱中平衡3天，每天换液，并用比胶孔孔径小的口吸管每天用mPZM-3冲洗胶孔确保胶孔中没有气泡，胶孔已被培养液充分浸透，第三次换液后盖上石蜡油，如图3。将整个培养盘称作Post Hatching Development PHD（Post Hatching Development）培养盘。
1. 3 将孵化后的胚胎移入准备好的胶孔中
3．1 培养液的调整
从我们目前掌握的实验结果来看，胚胎在放入培养液中存在“复苏”现象，这充分说明葡萄糖对胚胎的快速生长起到了促进作用。但胚胎在发育过程中存在复杂的代谢过程，比如产物和有害物质，比如氨，氧根等的积累，这些都是有可能发生的。[18]同时，除了葡萄糖，我们并没有尝试其他的营养物质，也许会有更好的营养物质的存在。对于葡萄糖浓度，其实并不是越高越好，同时葡萄糖在胚胎发育的早期是由不利影响的。在牛方面，已经有实验证明FBS的浓度越高，胚胎的发育效果越好，[9]可能是由于FSA中有许多未知的生长因子，同时，FBS对胚胎也许起到的物理方面的作用，但这个并没有被探明。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/dwyx/1060.html
