假孕大鼠黄体退化过程中ATF3的表达研究
假孕大鼠黄体退化过程中ATF3的表达研究[20200510204758]
摘要：骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一群存在于骨髓中具有不断增殖和自我更新能力的成体干细胞，其中向生殖细胞分化的能力使得其备受关注，对BMSCs进行转基因修饰可以使其分化为生殖细胞。DAZL基因在生殖细胞发育早期至配子产生的过程中持续表达，是调控生殖细胞发育与分化的关键基因。本试验尝试利用DAZL基因在生殖细胞中的作用，通过过表达DAZL基因诱导山羊BMSCs向生殖细胞分化。结果显示：过表达DAZL基因的山羊BMSCs可以顺利表达早期生殖细胞特异相关基因SCP3，DAZL和MVH基因，且相比质粒的过表达方法，mRNA过表达方法可以提高MVH基因的表达水平。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
关键字:山羊；DAZL基因；骨髓间充质干细胞；生殖细胞
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1.1.1 实验动物 2
1.1.2 主要仪器设备 2
1.1.3 主要试剂 2
1.1.4 试验用引物 2
1.2 试验方法 3
1.2.1 山羊骨髓间充质干细胞的培养 3
1.2.2 DAZL cDNA的扩增与克隆 3
1.2.3 pEGFP-DAZL真核表达载体的构建 3
1.2.4 T7体外转录 3
1.2.5 过表达DAZL转染山羊骨髓间充质干细胞及其检测 3
1.2.6 统计分析 4
2 结果 4
2.1山羊BMSCs细胞的一般形态 4
2.2质粒鉴定和体外转录的DAZL mRNA的合成 4
2.3过表达DAZL基因对BMSCs转分化为生殖细胞的影响 5
3 讨论 6
致谢 7
参考文献 8
过表达DAZL基因对山羊骨髓间充质干细胞
向生殖细胞分化的促进作用
引言
生殖细胞携带基因传给下一代，在物种的延续中占有重要地位，调控和提高配子质量可以为畜牧业的品质优化和提升提供很好的途经。成体干细胞因其具有一定的多能性和取材方便等特性成为研究生殖细胞的很好模型。BMSCs是一群存在于骨髓中具有不断增殖和自我更新能力的成体干细胞，BMSCs具有取材方便、体外易培养、增殖快和免疫原性低等优点。在人、小鼠、大鼠、兔和猪等物种中的研究都已经证明了该类干细胞具 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
有体外分化为多种细胞表型的能力，因此该细胞为研究生殖细胞发生机理提供更好的平台。
关于BMSCs的转分化研究也发现，基因的过表达法可诱导其转分化为成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、胰岛细胞等，这势必为研究BMSCs向生殖细胞的体外分化提供了新的途径[1]。DAZL是DAZ基因家族（包括Daz, Dazl和Bouble）中非常重要的一员，是表达生殖细胞特异RNA结合蛋白的基因，人和多种动物的DAZL基因是精子发生的重要调控因子[2]。DAZL基因最早由Eberhart[3]克隆于蝇类睾丸组织，在睾丸组织和卵巢组织中都有表达[4]。对人、小鼠、爪蟾和蝇类等 DAZL 基因的生物学功能研究表明，DAZL蛋白通过RRM和mRNA结合，以多聚体的方式参与mRNA的翻译起始，是精子发生的重要调控因子[5]。干扰破坏机体DAZL功能将导致性腺内生殖细胞退化缺失。雄性小鼠DAZL缺失会引起A型精原细胞从到A1型精原细胞减数分裂停滞，雌性小鼠敲除DAZL基因会导致成熟卵巢内生殖细胞和卵泡的短缺。Vogel T[6]等将人类DAZL基因导入敲除DAZL基因的小鼠体内,结果有大量早期生殖细胞产生。Yu[7]等证明利用siRNAs敲除DAZL基因会引起Stella,MVH和Prdml的表达量下降，而DAZL基因的暂态过表达会诱导GCNA表达但却抑制了Nanog的表达量。由此可见，DAZL基因在脊椎动物亚门各物种间的功能相似，是配子发生过程中的重要调控因，但目前关于DAZL基因的研究主要集中在人类和模式动物中，国内外很少见山羊DAZL基因的相关报道。
传统的质粒方法是过表达基因的常用手段，但有研究报道表明：用修饰过的编码四个转录因子的mRNA转染人角质化细胞，成功获得了重编程的诱导多能干细胞，且其诱导效率比最初四因子病毒的诱导方法高出了70倍[8]。因此本试验拟采用两种不同的方法来过表达DAZL基因，即传统的质粒方法和mRNA合成的方法。
对于成体干细胞向生殖细胞分化的研究，大多局限于体外诱导剂的诱导，很少有研究转基因的方式实现转分化这一过程。因此本试验首次尝试过表达DAZL基因诱导山羊BMSCs向生殖细胞分化，通过检测生殖细胞相关基因的表达来研究DAZL基因对山羊骨髓间充质干细胞向生殖细胞分化的促进作用。
1 材料和方法
1．1 材料
1．1．1 试验动物
pDAZL-EGFP 质粒和山羊骨髓间充质干细胞由动物胚胎工程技术中心保存。
1．1．2 主要仪器设备
全自动凝胶成像系统 （上海培清公司）
PCR扩增仪（美国biorad公司）
CO2培养箱（美国thermo公司）
电泳仪DYIII3A型（北京六一器械厂）
净化工作台（苏州净化）
倒置显微镜（Plympus）
5417R型台式冷冻高速离心机（德国Eppendorf公司）
低温冷冻离心机J2-MI型（德国Beckman公司）
数显恒温水浴锅HH-6型（国华电器有限公司）
荧光定量PCR仪（ABI公司）
1．1．３ 主要试剂
低糖DMEM、胎牛血清、L-谷氨酰胺、双抗、胰蛋白酶(Gibco公司)
质粒抽提试剂盒（Omega *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
公司）
LipofectamineTM2000、Trizol试剂（Invitrogen公司）
LA Taq DNA聚合酶、RT-PCR反转录试剂盒和荧光定量试剂盒(大连宝生物公司)
1．1．４ 试验用引物
表１山羊骨髓间充质干细胞quantitative RT-PCR所用引物
基因 Gene 引物序列（5–3） Primers sequence 片段大小/bp Size of PCR product 退火温度/?C Annealing temperature
GAPDH aacgtgtccgttgtggatct gagtgtcgctgttgaagtcg 157 60
SCP3 gtatggaggacttggaga gagactttcggacacttgc 138 58
DAZL tcgaactggtgtgtccaaag ctgaaatcgtggtggaggag 220 59
MVH cctcctccacctgaagatga ccatcaaatctcgtcctcct 199 59
1．2 试验方法
1．2．1 山羊骨髓间充质干细胞的培养
将实验室前期已冷冻的BMSCs进行解冻培养。
1．2．2 pDAZL-EGFP质粒提取
参照质粒抽提试剂盒说明书提取pDAZL-EGFP 质粒。
1．2．3 T7体外转录
通过PCR方法，以pDAZL-EGFP质粒为模板扩增目的片段DNA；在一个RNase-free 的塑料离心管中，在室温下按次序加入下列成分：转录反应缓冲液，RNase-free，DNA模板，dNTP(Mix)；用封口膜包好管口，60℃水浴30min，使反应体系中的RNase抑制物充分发挥作用，以去除模板中的RNase；待反应体系冷却后加入1ul T7 RNA 聚合酶，37℃保温2小时。注意：延长保温时间不能明显提高产量；70℃加热10分钟灭活T7 RNA聚合酶；得到的RNA可以放-80℃保存。
摘要：骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一群存在于骨髓中具有不断增殖和自我更新能力的成体干细胞，其中向生殖细胞分化的能力使得其备受关注，对BMSCs进行转基因修饰可以使其分化为生殖细胞。DAZL基因在生殖细胞发育早期至配子产生的过程中持续表达，是调控生殖细胞发育与分化的关键基因。本试验尝试利用DAZL基因在生殖细胞中的作用，通过过表达DAZL基因诱导山羊BMSCs向生殖细胞分化。结果显示：过表达DAZL基因的山羊BMSCs可以顺利表达早期生殖细胞特异相关基因SCP3，DAZL和MVH基因，且相比质粒的过表达方法，mRNA过表达方法可以提高MVH基因的表达水平。
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关键字:山羊；DAZL基因；骨髓间充质干细胞；生殖细胞
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1.1.1 实验动物 2
1.1.2 主要仪器设备 2
1.1.3 主要试剂 2
1.1.4 试验用引物 2
1.2 试验方法 3
1.2.1 山羊骨髓间充质干细胞的培养 3
1.2.2 DAZL cDNA的扩增与克隆 3
1.2.3 pEGFP-DAZL真核表达载体的构建 3
1.2.4 T7体外转录 3
1.2.5 过表达DAZL转染山羊骨髓间充质干细胞及其检测 3
1.2.6 统计分析 4
2 结果 4
2.1山羊BMSCs细胞的一般形态 4
2.2质粒鉴定和体外转录的DAZL mRNA的合成 4
2.3过表达DAZL基因对BMSCs转分化为生殖细胞的影响 5
3 讨论 6
致谢 7
参考文献 8
过表达DAZL基因对山羊骨髓间充质干细胞
向生殖细胞分化的促进作用
引言
生殖细胞携带基因传给下一代，在物种的延续中占有重要地位，调控和提高配子质量可以为畜牧业的品质优化和提升提供很好的途经。成体干细胞因其具有一定的多能性和取材方便等特性成为研究生殖细胞的很好模型。BMSCs是一群存在于骨髓中具有不断增殖和自我更新能力的成体干细胞，BMSCs具有取材方便、体外易培养、增殖快和免疫原性低等优点。在人、小鼠、大鼠、兔和猪等物种中的研究都已经证明了该类干细胞具 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
有体外分化为多种细胞表型的能力，因此该细胞为研究生殖细胞发生机理提供更好的平台。
关于BMSCs的转分化研究也发现，基因的过表达法可诱导其转分化为成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、胰岛细胞等，这势必为研究BMSCs向生殖细胞的体外分化提供了新的途径[1]。DAZL是DAZ基因家族（包括Daz, Dazl和Bouble）中非常重要的一员，是表达生殖细胞特异RNA结合蛋白的基因，人和多种动物的DAZL基因是精子发生的重要调控因子[2]。DAZL基因最早由Eberhart[3]克隆于蝇类睾丸组织，在睾丸组织和卵巢组织中都有表达[4]。对人、小鼠、爪蟾和蝇类等 DAZL 基因的生物学功能研究表明，DAZL蛋白通过RRM和mRNA结合，以多聚体的方式参与mRNA的翻译起始，是精子发生的重要调控因子[5]。干扰破坏机体DAZL功能将导致性腺内生殖细胞退化缺失。雄性小鼠DAZL缺失会引起A型精原细胞从到A1型精原细胞减数分裂停滞，雌性小鼠敲除DAZL基因会导致成熟卵巢内生殖细胞和卵泡的短缺。Vogel T[6]等将人类DAZL基因导入敲除DAZL基因的小鼠体内,结果有大量早期生殖细胞产生。Yu[7]等证明利用siRNAs敲除DAZL基因会引起Stella,MVH和Prdml的表达量下降，而DAZL基因的暂态过表达会诱导GCNA表达但却抑制了Nanog的表达量。由此可见，DAZL基因在脊椎动物亚门各物种间的功能相似，是配子发生过程中的重要调控因，但目前关于DAZL基因的研究主要集中在人类和模式动物中，国内外很少见山羊DAZL基因的相关报道。
传统的质粒方法是过表达基因的常用手段，但有研究报道表明：用修饰过的编码四个转录因子的mRNA转染人角质化细胞，成功获得了重编程的诱导多能干细胞，且其诱导效率比最初四因子病毒的诱导方法高出了70倍[8]。因此本试验拟采用两种不同的方法来过表达DAZL基因，即传统的质粒方法和mRNA合成的方法。
对于成体干细胞向生殖细胞分化的研究，大多局限于体外诱导剂的诱导，很少有研究转基因的方式实现转分化这一过程。因此本试验首次尝试过表达DAZL基因诱导山羊BMSCs向生殖细胞分化，通过检测生殖细胞相关基因的表达来研究DAZL基因对山羊骨髓间充质干细胞向生殖细胞分化的促进作用。
1 材料和方法
1．1 材料
1．1．1 试验动物
pDAZL-EGFP 质粒和山羊骨髓间充质干细胞由动物胚胎工程技术中心保存。
1．1．2 主要仪器设备
全自动凝胶成像系统 （上海培清公司）
PCR扩增仪（美国biorad公司）
CO2培养箱（美国thermo公司）
电泳仪DYIII3A型（北京六一器械厂）
净化工作台（苏州净化）
倒置显微镜（Plympus）
5417R型台式冷冻高速离心机（德国Eppendorf公司）
低温冷冻离心机J2-MI型（德国Beckman公司）
数显恒温水浴锅HH-6型（国华电器有限公司）
荧光定量PCR仪（ABI公司）
1．1．３ 主要试剂
低糖DMEM、胎牛血清、L-谷氨酰胺、双抗、胰蛋白酶(Gibco公司)
质粒抽提试剂盒（Omega *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
公司）
LipofectamineTM2000、Trizol试剂（Invitrogen公司）
LA Taq DNA聚合酶、RT-PCR反转录试剂盒和荧光定量试剂盒(大连宝生物公司)
1．1．４ 试验用引物
表１山羊骨髓间充质干细胞quantitative RT-PCR所用引物
基因 Gene 引物序列（5–3） Primers sequence 片段大小/bp Size of PCR product 退火温度/?C Annealing temperature
GAPDH aacgtgtccgttgtggatct gagtgtcgctgttgaagtcg 157 60
SCP3 gtatggaggacttggaga gagactttcggacacttgc 138 58
DAZL tcgaactggtgtgtccaaag ctgaaatcgtggtggaggag 220 59
MVH cctcctccacctgaagatga ccatcaaatctcgtcctcct 199 59
1．2 试验方法
1．2．1 山羊骨髓间充质干细胞的培养
将实验室前期已冷冻的BMSCs进行解冻培养。
1．2．2 pDAZL-EGFP质粒提取
参照质粒抽提试剂盒说明书提取pDAZL-EGFP 质粒。
1．2．3 T7体外转录
通过PCR方法，以pDAZL-EGFP质粒为模板扩增目的片段DNA；在一个RNase-free 的塑料离心管中，在室温下按次序加入下列成分：转录反应缓冲液，RNase-free，DNA模板，dNTP(Mix)；用封口膜包好管口，60℃水浴30min，使反应体系中的RNase抑制物充分发挥作用，以去除模板中的RNase；待反应体系冷却后加入1ul T7 RNA 聚合酶，37℃保温2小时。注意：延长保温时间不能明显提高产量；70℃加热10分钟灭活T7 RNA聚合酶；得到的RNA可以放-80℃保存。
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