猪链球菌裂解酶plygbs1249的结构域功能分析
确定猪链球菌裂解酶PlyGBS1249的酶活结构域，来为改造裂解酶提供一定的理论基础，从而为之后猪链球菌病提供新的防治思路。通过表达纯化PlyGBS1249三个结构域（MurNAc-LAA、CHAP和LysMR），将重组蛋白倍比稀释后，通过浊度递减实验来判断裂菌活性，从而对酶活结构域进行特性分析；利用与GFP串联表达的方式来对裂解酶细胞壁结构域（LysMR）进行功能分析。结果发现，分段表达的结构域 MurNAc-LAA与CHAP具有裂解作用，MurNAc-LAA的裂解活性更接近与全长裂解酶PlyGBS1249，推测MurNAc-LAA是起主要裂解作用的结构域；LysMR-GFP表达纯化的蛋白可结合猪链球菌细胞壁。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1 实验材料4
1.1.1 菌种来源4
1.1.2 主要试剂与仪器4
1.1.3 引物设计4
1.2 方法 4
1.2.1 获得目的基因和质粒提取4
1.2.2 双酶切5
1.2.3 连接和转化5
1.2.4 PCR鉴定及测序鉴定6
1.2.5 重组质粒转化至表达菌BL21中6
1.2.6 蛋白的小剂量诱导表达6
1.2.7 SDSPAGE电泳7
1.2.8 蛋白的大剂量诱导表达7
1.2.9 蛋白纯化与超滤浓缩7
1.2.10 BCA工作液测蛋白浓度8
1.2.11 酶学性质分析8
1．2．12 裂解酶细胞壁结构域的功能分析8
2 结果与分析8
2.1 基因片段的扩增和重组质粒的鉴定8
2.2 重组质粒的测序鉴定9
2.3 蛋白表达的SDSPAGE电泳检测9
2.4 BCA蛋白浓度检测10
2.5 裂解活性分析10
2.6 裂解酶细胞壁结构域的功能分析11
2.6.1 LysMRGFP重组质粒鉴定结果11
2. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
6.2 LysMRGFP重组质粒的测序鉴定11
2.6.3 LysMRGFP SDSPAGE结果及功能分析11
3 讨论 12
3.1 猪链球菌裂解酶的研究进展12
3.2 PlyGBS1249的功能分析及讨论13
致谢13
参考文献13
猪链球菌裂解酶PlyGBS1249酶活结构域的确定
引言
引言
猪链球菌(Streptococcus suis)能引起猪的败血症、脑膜炎、肺炎、多发性关节炎和多发性浆膜炎等；在特定情况下，该菌也能感染人，引起人的急性败血症、脑膜炎、心内膜炎等疾病[1]，是一种重要的人畜共患病病原。而随着抗生素的滥用，耐药性猪链球菌出现，导致猪链球菌病的防治越发困难[2,3,4,5]。基于噬菌体裂解酶的高效、专一的抗菌活性，将其开发成新型的抗菌药物,具有极佳的应用前景，尤其在猪链球菌病的防治中，避免了常规耐药性菌株的出现，可提供更好的保护力，菌体也不会对噬菌体产生抗性，发掘和应用高性能的裂解酶更具理论和实用价值[6,7,8]。研究表明，国内外猪链球菌裂解性噬菌体仅分离到的唯一一种SMP [9]，因此使用其来防控耐药性猪链球菌尚存在一定难度[10]。目前针对猪链球菌2型的噬菌体裂解酶研究有待进一步深入，以找到高效广谱的裂解酶。
虽然PlyGBS1249的裂菌活性已经确认，但对其结构域的功能分析和关键结构域仍尚未明晰，因此本文拟通过分段表达 PlyGBS1249 结构域（MurNAcLAA；LysMR；CHAP），比较分段后蛋白的裂解特性和基本作用，来确定其核心功能域和活性片段，进而为改造裂解酶提供重要实验数据。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 菌种来源
所用猪链球菌CZ130302强毒菌株，分离自2013年3月至5月江苏常州某猪场大量断奶仔猪发病个体，由本实验室保存。
实验所有pET28a 载体由Takamatsu 构建。
商品化的大肠杆菌DH5α株感受态及BL21 株感受态都购自北京博迈德生物公司，由本实验室保存。
1．1．2 主要试剂与仪器
主要试剂有：
LB 液体培养基（酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠10g，定容至1L，115℃高压蒸汽灭菌20min）
LB 固体培养基（酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠 10g、琼脂5g，定容至1L，115℃高压蒸汽灭菌20min，当温度降至55℃左右，加入卡那抗性至终浓度为50μg/mL，后倒入无菌一次性培养皿中，冷却后保存在4℃）
IPTG（异丙基—β—D—硫代半乳糖苷）
5×PBS（NaCl 40g，KCl 1g，KH2PO4 1g,，Na2HPO4 3.05 g，定容至1 L，稀释5倍使用）
上清溶解buffer（0.5M NaCl 14.61g、20mM Na3PO4 3.8g、30mM 咪唑1.02g，定容至500mL）
上清洗脱缓冲液（0.5M NaCl 14.61g、20mM Na3PO4 3.8g、0.5M 咪唑17.02g，定容至500mL）
冻存液（50%甘油缓冲液）
蛋白胶染色液（考马斯亮蓝R250 1.2g/L ；甲醇：水：乙酸 （5：4：1 或 4.5：4.5：1））
蛋白胶脱色液（甲醇：水：乙酸 （5：4：1 或 4.5：4.5：1））等。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1 实验材料4
1.1.1 菌种来源4
1.1.2 主要试剂与仪器4
1.1.3 引物设计4
1.2 方法 4
1.2.1 获得目的基因和质粒提取4
1.2.2 双酶切5
1.2.3 连接和转化5
1.2.4 PCR鉴定及测序鉴定6
1.2.5 重组质粒转化至表达菌BL21中6
1.2.6 蛋白的小剂量诱导表达6
1.2.7 SDSPAGE电泳7
1.2.8 蛋白的大剂量诱导表达7
1.2.9 蛋白纯化与超滤浓缩7
1.2.10 BCA工作液测蛋白浓度8
1.2.11 酶学性质分析8
1．2．12 裂解酶细胞壁结构域的功能分析8
2 结果与分析8
2.1 基因片段的扩增和重组质粒的鉴定8
2.2 重组质粒的测序鉴定9
2.3 蛋白表达的SDSPAGE电泳检测9
2.4 BCA蛋白浓度检测10
2.5 裂解活性分析10
2.6 裂解酶细胞壁结构域的功能分析11
2.6.1 LysMRGFP重组质粒鉴定结果11
2. *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
6.2 LysMRGFP重组质粒的测序鉴定11
2.6.3 LysMRGFP SDSPAGE结果及功能分析11
3 讨论 12
3.1 猪链球菌裂解酶的研究进展12
3.2 PlyGBS1249的功能分析及讨论13
致谢13
参考文献13
猪链球菌裂解酶PlyGBS1249酶活结构域的确定
引言
引言
猪链球菌(Streptococcus suis)能引起猪的败血症、脑膜炎、肺炎、多发性关节炎和多发性浆膜炎等；在特定情况下，该菌也能感染人，引起人的急性败血症、脑膜炎、心内膜炎等疾病[1]，是一种重要的人畜共患病病原。而随着抗生素的滥用，耐药性猪链球菌出现，导致猪链球菌病的防治越发困难[2,3,4,5]。基于噬菌体裂解酶的高效、专一的抗菌活性，将其开发成新型的抗菌药物,具有极佳的应用前景，尤其在猪链球菌病的防治中，避免了常规耐药性菌株的出现，可提供更好的保护力，菌体也不会对噬菌体产生抗性，发掘和应用高性能的裂解酶更具理论和实用价值[6,7,8]。研究表明，国内外猪链球菌裂解性噬菌体仅分离到的唯一一种SMP [9]，因此使用其来防控耐药性猪链球菌尚存在一定难度[10]。目前针对猪链球菌2型的噬菌体裂解酶研究有待进一步深入，以找到高效广谱的裂解酶。
虽然PlyGBS1249的裂菌活性已经确认，但对其结构域的功能分析和关键结构域仍尚未明晰，因此本文拟通过分段表达 PlyGBS1249 结构域（MurNAcLAA；LysMR；CHAP），比较分段后蛋白的裂解特性和基本作用，来确定其核心功能域和活性片段，进而为改造裂解酶提供重要实验数据。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 菌种来源
所用猪链球菌CZ130302强毒菌株，分离自2013年3月至5月江苏常州某猪场大量断奶仔猪发病个体，由本实验室保存。
实验所有pET28a 载体由Takamatsu 构建。
商品化的大肠杆菌DH5α株感受态及BL21 株感受态都购自北京博迈德生物公司，由本实验室保存。
1．1．2 主要试剂与仪器
主要试剂有：
LB 液体培养基（酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠10g，定容至1L，115℃高压蒸汽灭菌20min）
LB 固体培养基（酵母提取物5g、蛋白胨10g、氯化钠 10g、琼脂5g，定容至1L，115℃高压蒸汽灭菌20min，当温度降至55℃左右，加入卡那抗性至终浓度为50μg/mL，后倒入无菌一次性培养皿中，冷却后保存在4℃）
IPTG（异丙基—β—D—硫代半乳糖苷）
5×PBS（NaCl 40g，KCl 1g，KH2PO4 1g,，Na2HPO4 3.05 g，定容至1 L，稀释5倍使用）
上清溶解buffer（0.5M NaCl 14.61g、20mM Na3PO4 3.8g、30mM 咪唑1.02g，定容至500mL）
上清洗脱缓冲液（0.5M NaCl 14.61g、20mM Na3PO4 3.8g、0.5M 咪唑17.02g，定容至500mL）
冻存液（50%甘油缓冲液）
蛋白胶染色液（考马斯亮蓝R250 1.2g/L ；甲醇：水：乙酸 （5：4：1 或 4.5：4.5：1））
蛋白胶脱色液（甲醇：水：乙酸 （5：4：1 或 4.5：4.5：1））等。
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