昆虫细胞悬浮培养增殖重组杆状病毒条件优化
昆虫细胞杆状病毒表达系统被广泛用于高效表达外源蛋白的载体系统。本研究对sf9细胞摇瓶悬浮培养过程及利用sf9细胞摇瓶悬浮培养增殖杆状病毒条件进行了优化。在sf9细胞摇瓶悬浮培养120 h达到生长顶峰8×106 cell/ml时，测得 Gluc(mm)6.9 ；Gln(mm)6.27 ；Lac(mm)15.6；NH4+(mm)25.73。对在摇瓶中增殖杆状病毒工艺优化进行研究，用正交实验讨论细胞初始浓度(ICD)和感染复数(MOI)间的关系，接毒后96 h收毒检测。实验结果表明，当初始密度在1×106 cell/mL，MOI为1的条件下，病毒效价达到最大8.6×107 /mL。研究收毒时间与收毒量的关系，在96 h取得最大收毒量。本研究为sf9细胞摇瓶悬浮培养条件化及利用昆虫杆状病毒蛋白表达系统高效表达重组蛋白生产奠定了坚实基础。
目录
摘要 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1．1．1 细胞和病毒 2
1．1．2 培养基及试剂 2
1．1．3 实验设备 2
1．2 方法 2
1．2．1 细胞摇瓶悬浮培养 2
1．2. 2 生化分析与细胞监测 2
1．2．3 病毒含量检测 2
1．2．4 sf9昆虫细胞悬浮培养生长曲线 2
1．2．5 重组杆状病毒增殖优化 2
2 结果与分析 3
2．1 sf9细胞摇瓶悬浮培养 3
2．2 杆状病毒增殖优化 3
2．2．1 不同接毒量的优化 3
2．2．2 不同细胞初始密度的优化 3
2．2．3 不同病毒收获时间的优化 4
3 讨论 4
3．1 sf9细胞摇瓶悬培养 4
3．2昆虫细胞杆状病毒表达系统的影响因素 4
3．2．1 接毒剂量的影响 4
3．2．2 细胞初始浓度的影响 5
3．2．3 收获时间的影响 5
3．3 展望 5
致谢 6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
参考文献： 6
昆虫细胞悬浮培养增殖重组杆状病毒条件优化
引言
昆虫细胞杆状病毒表达系统是1983年发展起来的新型表达载体系统，据报道目前已经成功应用于数千种外源蛋白的表达［1］。随着昆虫细胞系及昆虫细胞培养技术重要性的显现，昆虫细胞的应用越来越受到人们的重视,逐步成为开展各种研究的必备材料, 广泛应用于内分泌学、分子生物学、细胞生物学、分子生物学、免疫学等医学基础研究的多个领域[25]，也用于病毒诊断，病毒农药和疫苗的研发生产等。其中已经商品化的兽用疫苗有四种，用于猪瘟预防的是拜尔AG 研发的Bayovac CSF E2疫苗和Merck研制的Porcilis Pesti疫苗；用于2型猪圆环病毒(Porcine circovirus type 2，PCV2)预防的Merck研制的Procilis PCV疫苗和Boehringer Ingelheim研制的Ingelvac Circo FLEX疫苗。目前，昆虫细胞杆状病毒表达系统在实际应用中依然存在有很多的问题，如DO含量对病毒产量的影响,培养基的pH对细胞和病毒增殖的影响，昆虫细胞对血清的依赖性，接毒时间接毒量和接毒时初始细胞密度收毒时间等都会对收毒量有较大影响[6]。因此需要对其生产过程进行优化。 近年来，人们主要在以下几个方面进行了优化: a． 细胞生长情况［7］，本实验选择的是对数生长期的细胞进行试验，此时的细胞状态最好；b． 培养基［89］； c． 培养基溶氧； d．生物反应器的设计［10］；e． 感染策略［1114］，其中包括感染复数(MOI) 、感染时间(TOI)、细胞初始浓度(ICD)。本试验研究了初始细胞密度、接毒量(MOI)和收毒时间对重组杆状病毒增殖的影响以及sf9昆虫细胞培养过程中细胞密度及营养代谢情况，以其为实际生产选择合适的细胞浓度和接毒量(MOI)提供帮助。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 细胞和病毒 sf9 昆虫细胞购于Invitrigen公司。表达猪圆环病毒ORF1的重组杆状病毒rPCV2ORF1由江苏省农科院国家兽用生物制品工程技术研究中心构建，病毒效价TCID50=107.5/mL。
1．1．2 培养基及试剂 sf900Ⅱ无血清培养基购于GIBCO公司， PCV2阳性血清购于中国药监局，FITC标记GoatantiPig IgG 购于博士德公司。
1．1．3 实验设备 瑞士比欧细胞振荡培养箱、Nova 生化分析仪、Beckman 高速离心机、Hitachi 冷冻台式离心机。
1．2 方法
1．2．1 细胞摇瓶悬浮培养 细胞摇瓶悬浮培养昆虫细胞经克氏瓶静止培养复苏后，以传代后初始密度不低于2.5×105 cell/mL，细胞的接种量逐步放大到250 mL摇瓶，摇瓶装液体积为5060 mL，要求细胞生长密度不高于5×106 cell/mL时进行传代。sf900Ⅱ无血清培养基培养，培养温度27 ℃，摇床转速90120 r/min。
1．2. 2 生化分析与细胞监测 取样，EP管3000 r/min低温离心，取上清，严格按照Nova生化分析仪操作要求检测葡萄糖、氨、乳酸及谷氨酰胺。细胞通过血球计数板来计数，经台盼蓝染色来测定细胞活性。
1．2．3 病毒含量检测 收获Sf9细胞进行细胞计数后铺于六孔板，每孔l ×106个细胞，27 ℃孵育l h后弃去六孔板中的细胞培养液，接种以新鲜sf900 Ⅱ SFM培养液进行10倍稀释(103l08)的重组杆状病毒液；27 ℃温箱孵育120 h后，用4 ℃预冷的丙酮甲醛(1∶1)固定液于20 ℃固定5 min，PBST洗涤3次，自然风干；加入1∶1000稀释的猪圆环病毒阳性血清，37 ℃作用l h；用PBST洗涤3次后，加入1∶200稀释的FITC标记GoatantiPig IgG，37 ℃作用l h；用PBST洗涤3次，甩干后荧光显微镜下观察结果，未感染的sf9昆虫细胞同时作对照。Karber法计算TCID50的值。
1．2．4 sf9昆虫细胞悬浮培养生长曲线 昆虫细胞sf9以初始密度0.5×106 个/mL进行悬浮培养，培养温度27 ℃，摇床转速80 r/min，培养120 h，每隔24 h取样，检测细胞密度、细胞活性及代谢分析。
1．2．5 重组杆状病毒增殖优化
1．2．5. 1 不同接毒量的优化 sf9细胞摇瓶悬浮培养至4×106 cell/mL，离心收集细胞沉淀；采用新鲜的培养基按照初始密度1×106 cell/mL重悬细胞；以不同接毒量（MOI）感染细胞，分为高中低三个浓度组。接毒后120 h检测细胞收获病毒，TCID50法检测病毒效价。重复试验三次，详细分组情况及结果见表2。
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摘要 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1．1．1 细胞和病毒 2
1．1．2 培养基及试剂 2
1．1．3 实验设备 2
1．2 方法 2
1．2．1 细胞摇瓶悬浮培养 2
1．2. 2 生化分析与细胞监测 2
1．2．3 病毒含量检测 2
1．2．4 sf9昆虫细胞悬浮培养生长曲线 2
1．2．5 重组杆状病毒增殖优化 2
2 结果与分析 3
2．1 sf9细胞摇瓶悬浮培养 3
2．2 杆状病毒增殖优化 3
2．2．1 不同接毒量的优化 3
2．2．2 不同细胞初始密度的优化 3
2．2．3 不同病毒收获时间的优化 4
3 讨论 4
3．1 sf9细胞摇瓶悬培养 4
3．2昆虫细胞杆状病毒表达系统的影响因素 4
3．2．1 接毒剂量的影响 4
3．2．2 细胞初始浓度的影响 5
3．2．3 收获时间的影响 5
3．3 展望 5
致谢 6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
参考文献： 6
昆虫细胞悬浮培养增殖重组杆状病毒条件优化
引言
昆虫细胞杆状病毒表达系统是1983年发展起来的新型表达载体系统，据报道目前已经成功应用于数千种外源蛋白的表达［1］。随着昆虫细胞系及昆虫细胞培养技术重要性的显现，昆虫细胞的应用越来越受到人们的重视,逐步成为开展各种研究的必备材料, 广泛应用于内分泌学、分子生物学、细胞生物学、分子生物学、免疫学等医学基础研究的多个领域[25]，也用于病毒诊断，病毒农药和疫苗的研发生产等。其中已经商品化的兽用疫苗有四种，用于猪瘟预防的是拜尔AG 研发的Bayovac CSF E2疫苗和Merck研制的Porcilis Pesti疫苗；用于2型猪圆环病毒(Porcine circovirus type 2，PCV2)预防的Merck研制的Procilis PCV疫苗和Boehringer Ingelheim研制的Ingelvac Circo FLEX疫苗。目前，昆虫细胞杆状病毒表达系统在实际应用中依然存在有很多的问题，如DO含量对病毒产量的影响,培养基的pH对细胞和病毒增殖的影响，昆虫细胞对血清的依赖性，接毒时间接毒量和接毒时初始细胞密度收毒时间等都会对收毒量有较大影响[6]。因此需要对其生产过程进行优化。 近年来，人们主要在以下几个方面进行了优化: a． 细胞生长情况［7］，本实验选择的是对数生长期的细胞进行试验，此时的细胞状态最好；b． 培养基［89］； c． 培养基溶氧； d．生物反应器的设计［10］；e． 感染策略［1114］，其中包括感染复数(MOI) 、感染时间(TOI)、细胞初始浓度(ICD)。本试验研究了初始细胞密度、接毒量(MOI)和收毒时间对重组杆状病毒增殖的影响以及sf9昆虫细胞培养过程中细胞密度及营养代谢情况，以其为实际生产选择合适的细胞浓度和接毒量(MOI)提供帮助。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 细胞和病毒 sf9 昆虫细胞购于Invitrigen公司。表达猪圆环病毒ORF1的重组杆状病毒rPCV2ORF1由江苏省农科院国家兽用生物制品工程技术研究中心构建，病毒效价TCID50=107.5/mL。
1．1．2 培养基及试剂 sf900Ⅱ无血清培养基购于GIBCO公司， PCV2阳性血清购于中国药监局，FITC标记GoatantiPig IgG 购于博士德公司。
1．1．3 实验设备 瑞士比欧细胞振荡培养箱、Nova 生化分析仪、Beckman 高速离心机、Hitachi 冷冻台式离心机。
1．2 方法
1．2．1 细胞摇瓶悬浮培养 细胞摇瓶悬浮培养昆虫细胞经克氏瓶静止培养复苏后，以传代后初始密度不低于2.5×105 cell/mL，细胞的接种量逐步放大到250 mL摇瓶，摇瓶装液体积为5060 mL，要求细胞生长密度不高于5×106 cell/mL时进行传代。sf900Ⅱ无血清培养基培养，培养温度27 ℃，摇床转速90120 r/min。
1．2. 2 生化分析与细胞监测 取样，EP管3000 r/min低温离心，取上清，严格按照Nova生化分析仪操作要求检测葡萄糖、氨、乳酸及谷氨酰胺。细胞通过血球计数板来计数，经台盼蓝染色来测定细胞活性。
1．2．3 病毒含量检测 收获Sf9细胞进行细胞计数后铺于六孔板，每孔l ×106个细胞，27 ℃孵育l h后弃去六孔板中的细胞培养液，接种以新鲜sf900 Ⅱ SFM培养液进行10倍稀释(103l08)的重组杆状病毒液；27 ℃温箱孵育120 h后，用4 ℃预冷的丙酮甲醛(1∶1)固定液于20 ℃固定5 min，PBST洗涤3次，自然风干；加入1∶1000稀释的猪圆环病毒阳性血清，37 ℃作用l h；用PBST洗涤3次后，加入1∶200稀释的FITC标记GoatantiPig IgG，37 ℃作用l h；用PBST洗涤3次，甩干后荧光显微镜下观察结果，未感染的sf9昆虫细胞同时作对照。Karber法计算TCID50的值。
1．2．4 sf9昆虫细胞悬浮培养生长曲线 昆虫细胞sf9以初始密度0.5×106 个/mL进行悬浮培养，培养温度27 ℃，摇床转速80 r/min，培养120 h，每隔24 h取样，检测细胞密度、细胞活性及代谢分析。
1．2．5 重组杆状病毒增殖优化
1．2．5. 1 不同接毒量的优化 sf9细胞摇瓶悬浮培养至4×106 cell/mL，离心收集细胞沉淀；采用新鲜的培养基按照初始密度1×106 cell/mL重悬细胞；以不同接毒量（MOI）感染细胞，分为高中低三个浓度组。接毒后120 h检测细胞收获病毒，TCID50法检测病毒效价。重复试验三次，详细分组情况及结果见表2。
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