犬流感病毒与伪中间葡萄球菌在Balbc小鼠体内的协同感染
犬流感病毒与伪中间葡萄球菌在Balbc小鼠体内的协同感染[20200507220142]
摘要：犬流感病毒和伪中间葡萄球菌均是引起呼吸道疾病的病原，可以通过呼吸道感染和传播。本试验在Balb/c小鼠上建立病毒-细菌共感染的模型来研究流感病毒和葡萄球菌的协同感染。试验分为4个组：对照组、细菌组、病毒组和病毒细菌共感染组，从临床症状、细菌载量、病理研变化三方面展开究。结果表明，细菌感染小鼠产生严重的神经症状，肺和脑有明显的病理变化：肺泡代偿性扩张、肺泡隔变宽、有巨噬细胞和炎性细胞；脑神经纤维溶解，有噬神经元现象，小胶质结节等。共感染组的体重明显低于细菌组和病毒组，差异极显著（P＜0.01）。细菌载量检测发现，细菌组和共感染组小鼠的血液和各脏器中均检测到葡萄球菌，在感染后第2天和第3天，共感染组小鼠各组织细菌载量均高于单独细菌感染组，但统计学上，除第二天脾脏上有显著差异外（P＜0.05），其余均无显著差异（P＞0.05）。结果表明，犬流感病毒和伪中间葡萄球菌共感染可明显抑制小鼠的生长，犬流感病毒的协同感染在一定程度上可加重小鼠对细菌的感染程度。
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关键字:犬流感病毒；伪中间葡萄球菌；协同感染；细菌载量；病理变化
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1试验材料 4
1.1.1菌种 4
1.1.2培养基及溶液配制 4
1.1.3试验动物 5
1.1.4试剂及耗材 5
1.1.5主要仪器 5
1.2试验方法 5
1.2.1 伪中间葡萄球菌生长曲线的测定 5
1.2.2 伪中间葡萄球菌的复苏和培养 5
1.2.3 MDCK细胞的复苏和培养 5
1.2.4犬流感病毒的复苏和培养 6
1.2.5小鼠葡萄球菌-流感病毒协同感染模型的建立 6
1.2.6感染Balb/c小鼠 6
1.2.7观察临床症状及体重变化 6
1.2.8测定细菌载量 6
1.2.9制作病理切片 7
2 结果与分析 8
2.1伪中间葡萄球菌生长曲线的测定结果 8
2.2体内试验 8
2.2.1观察临床症状及体重变化 8
2.2.2细菌载量 10
2.2.2病理变化 10
3.讨论 13
致谢 14
参考文献 14
犬流感病毒与伪中间葡萄球菌在Balb/c小鼠体内的协同感染
引言
犬流感（Canine influenza, CI）是由属于正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒的犬流感病毒（canine influenza virus, CIV）引起的犬呼吸道传染病。患犬主要临床症状为发烧、咳嗽、 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
流鼻液、食欲减退、精精神沉郁等。
自从2004年马源H3N8亚型犬流感在美国爆发，引起人们极大的关注，改变了此前人们认为的观点，即犬对流感病毒具有抵抗力的观点[1]。2007年，H3N2亚型的犬流感病毒在韩国首次报道，随后，在中国陆续分离到此亚型的犬流感病毒。2009年我国报告犬感染H1N1亚型流感病毒，基因序列分析表明该病毒与当时人群中流行的甲型H1N1流感病毒同源性高达99%[2]。2010在广东及江苏省也分离到犬流感。国外研究也证实H3N8、H5N1以及H3N2亚型流感病毒可跨越品种障碍而感染犬，H3N8、H3N2亚型CIV还可以在犬群中水平传播[3-5]。由于犬是人类最亲密的伴侣动物，与人密切接触机会较多，犬有可能会作为中间宿主将流感病毒传播给人类，因此犬流感病毒具有广泛的公共卫生学意义。虽然尚未证实犬在人类流感病毒演变过程中的作用，但在宠物犬中检测得到甲型H1N1流感病毒，足以引起研究人员的重视。
伪中间葡萄球菌与中间葡萄球菌密切相关，对甲氧西林敏感，有凝固酶、DNA酶和β-溶血素，存在引起动物和人类疾病的致病潜力。伪中间葡萄菌常存在于皮肤和粘膜，也可以从鼻孔、口、咽、额头，健康犬和猫的腹股沟和肛门被分离到[6-10]，50%的健康犬的皮肤、鼻子或肠道都有这种菌的存在，在健康猫上存在的比例较小[11-12]。它是一种条件致病菌，如果动物免疫力下降，削弱了身体的防御而引起感染和疾病。有调查表明，有4%的健康犬主人鼻液中分离到伪中间葡萄球菌，并在2005年已有首例人类感染此菌，除此之外马和鸟类也可感染。该菌常在犬皮肤脓包病例中出现，当皮肤有伤口是常感染此菌，手术伤口感染时首要原因[13-15]并产生严重的影响。
流感病毒的感染往往伴随着呼吸类细菌（如肺炎链球菌、金黄色葡萄球等）的继发感染，进而增加患者的发病率和死亡率。对于犬这一宿主来说，当犬被流感病毒感染时，同样可能引起呼吸道致病菌的继发感染[16]。
本实验中，犬流感病毒和伪中间葡萄球菌分别从一份犬的鼻咽拭子中分离得到，由于犬协同感染这两种病原还尚未报道，所以该实验研究犬流感病毒和伪中间葡萄球菌在Balb/c小鼠上的协同感染具有重要意义。这有利于加深对犬流感病毒和伪中间葡萄球菌的认识，建立小鼠感染模型，为研究和治疗该类疾病寻找新思路和新方法。
1 材料与方法
1.1试验材料
1.1.1菌种
伪中间葡萄球菌，由大学动物医学院博士生Dildar分离得到。从血平板上挑取单菌落复苏培养。伪中间葡萄球菌培养是用LB液体或者固体培养基，37℃恒温摇床或温箱培养。犬流感病毒A/Canine/Jiangsu/06/2010[17]是由大学微生物实验室分离得到的一株典型的甲型犬流感病毒，在多次试验中被选为对象。
1.1.2培养基及溶液配制
LB液体培养基：氯化钠（NaCl）10g、蛋白胨（Tryptone）10g、酵母粉（Yeast Extract）5g,用去离子水充分溶解定容至1L，115℃高压灭菌20min，放于80℃烘箱中30min后取出待用。
LB固体培养基：氯化钠（NaCl）10g、蛋白胨（Tryptone）10g、酵母粉（Yeast Extract）5g, 琼脂15g,用去离子水充分溶解定容至1L，115℃高压灭菌20min，放于80℃烘箱中10mi *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
n后取出，倒入一次性平板中，每块平板约15mL，待平板晾干后放于4℃冰箱中待用。
PBS Butter：氯化钠8.0 g、氯化钾0.2 g、十二水和磷酸氢二钠 3.5 g、磷酸二氢钾 0.27 g，去离子水充分溶解，调节pH至7.4，定容至1 L，高温高压灭菌后待用。
4%多聚甲醛：4g多聚甲醛加入到0.1M PBS中，定容至100 ml，加入适量1 mol/L NaOH促进溶解，调PH至7.4；
Bouin’s液：75mL苦味酸、25mL多聚甲醛、5mL冰醋酸加到一起混匀，分装待用。
1.1.3试验动物
8周龄体重相近的Balb/c雌性小鼠，购自扬州大学比较医学中心。
1.1.4试剂及耗材：
胰化蛋白脉(Tryptone) 江苏生兴生物有限公司
酵母提取物(Yeastextraet) 江苏生兴生物有限公司
琼脂糖 江苏生兴生物有限公司
一次性培养皿 泰州科健医疗用品有限公司
肝素钠 南京鼎国生物技术有限公司
二甲苯 南京鼎国生物技术有限公司
1.1.5主要仪器
光学显微镜 日本Olympus公司
超净工作台 苏州净化设备总厂
低温离心机 德国Eppendorf
摘要：犬流感病毒和伪中间葡萄球菌均是引起呼吸道疾病的病原，可以通过呼吸道感染和传播。本试验在Balb/c小鼠上建立病毒-细菌共感染的模型来研究流感病毒和葡萄球菌的协同感染。试验分为4个组：对照组、细菌组、病毒组和病毒细菌共感染组，从临床症状、细菌载量、病理研变化三方面展开究。结果表明，细菌感染小鼠产生严重的神经症状，肺和脑有明显的病理变化：肺泡代偿性扩张、肺泡隔变宽、有巨噬细胞和炎性细胞；脑神经纤维溶解，有噬神经元现象，小胶质结节等。共感染组的体重明显低于细菌组和病毒组，差异极显著（P＜0.01）。细菌载量检测发现，细菌组和共感染组小鼠的血液和各脏器中均检测到葡萄球菌，在感染后第2天和第3天，共感染组小鼠各组织细菌载量均高于单独细菌感染组，但统计学上，除第二天脾脏上有显著差异外（P＜0.05），其余均无显著差异（P＞0.05）。结果表明，犬流感病毒和伪中间葡萄球菌共感染可明显抑制小鼠的生长，犬流感病毒的协同感染在一定程度上可加重小鼠对细菌的感染程度。
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摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1试验材料 4
1.1.1菌种 4
1.1.2培养基及溶液配制 4
1.1.3试验动物 5
1.1.4试剂及耗材 5
1.1.5主要仪器 5
1.2试验方法 5
1.2.1 伪中间葡萄球菌生长曲线的测定 5
1.2.2 伪中间葡萄球菌的复苏和培养 5
1.2.3 MDCK细胞的复苏和培养 5
1.2.4犬流感病毒的复苏和培养 6
1.2.5小鼠葡萄球菌-流感病毒协同感染模型的建立 6
1.2.6感染Balb/c小鼠 6
1.2.7观察临床症状及体重变化 6
1.2.8测定细菌载量 6
1.2.9制作病理切片 7
2 结果与分析 8
2.1伪中间葡萄球菌生长曲线的测定结果 8
2.2体内试验 8
2.2.1观察临床症状及体重变化 8
2.2.2细菌载量 10
2.2.2病理变化 10
3.讨论 13
致谢 14
参考文献 14
犬流感病毒与伪中间葡萄球菌在Balb/c小鼠体内的协同感染
引言
犬流感（Canine influenza, CI）是由属于正黏病毒科流感病毒属A型流感病毒的犬流感病毒（canine influenza virus, CIV）引起的犬呼吸道传染病。患犬主要临床症状为发烧、咳嗽、 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
流鼻液、食欲减退、精精神沉郁等。
自从2004年马源H3N8亚型犬流感在美国爆发，引起人们极大的关注，改变了此前人们认为的观点，即犬对流感病毒具有抵抗力的观点[1]。2007年，H3N2亚型的犬流感病毒在韩国首次报道，随后，在中国陆续分离到此亚型的犬流感病毒。2009年我国报告犬感染H1N1亚型流感病毒，基因序列分析表明该病毒与当时人群中流行的甲型H1N1流感病毒同源性高达99%[2]。2010在广东及江苏省也分离到犬流感。国外研究也证实H3N8、H5N1以及H3N2亚型流感病毒可跨越品种障碍而感染犬，H3N8、H3N2亚型CIV还可以在犬群中水平传播[3-5]。由于犬是人类最亲密的伴侣动物，与人密切接触机会较多，犬有可能会作为中间宿主将流感病毒传播给人类，因此犬流感病毒具有广泛的公共卫生学意义。虽然尚未证实犬在人类流感病毒演变过程中的作用，但在宠物犬中检测得到甲型H1N1流感病毒，足以引起研究人员的重视。
伪中间葡萄球菌与中间葡萄球菌密切相关，对甲氧西林敏感，有凝固酶、DNA酶和β-溶血素，存在引起动物和人类疾病的致病潜力。伪中间葡萄菌常存在于皮肤和粘膜，也可以从鼻孔、口、咽、额头，健康犬和猫的腹股沟和肛门被分离到[6-10]，50%的健康犬的皮肤、鼻子或肠道都有这种菌的存在，在健康猫上存在的比例较小[11-12]。它是一种条件致病菌，如果动物免疫力下降，削弱了身体的防御而引起感染和疾病。有调查表明，有4%的健康犬主人鼻液中分离到伪中间葡萄球菌，并在2005年已有首例人类感染此菌，除此之外马和鸟类也可感染。该菌常在犬皮肤脓包病例中出现，当皮肤有伤口是常感染此菌，手术伤口感染时首要原因[13-15]并产生严重的影响。
流感病毒的感染往往伴随着呼吸类细菌（如肺炎链球菌、金黄色葡萄球等）的继发感染，进而增加患者的发病率和死亡率。对于犬这一宿主来说，当犬被流感病毒感染时，同样可能引起呼吸道致病菌的继发感染[16]。
本实验中，犬流感病毒和伪中间葡萄球菌分别从一份犬的鼻咽拭子中分离得到，由于犬协同感染这两种病原还尚未报道，所以该实验研究犬流感病毒和伪中间葡萄球菌在Balb/c小鼠上的协同感染具有重要意义。这有利于加深对犬流感病毒和伪中间葡萄球菌的认识，建立小鼠感染模型，为研究和治疗该类疾病寻找新思路和新方法。
1 材料与方法
1.1试验材料
1.1.1菌种
伪中间葡萄球菌，由大学动物医学院博士生Dildar分离得到。从血平板上挑取单菌落复苏培养。伪中间葡萄球菌培养是用LB液体或者固体培养基，37℃恒温摇床或温箱培养。犬流感病毒A/Canine/Jiangsu/06/2010[17]是由大学微生物实验室分离得到的一株典型的甲型犬流感病毒，在多次试验中被选为对象。
1.1.2培养基及溶液配制
LB液体培养基：氯化钠（NaCl）10g、蛋白胨（Tryptone）10g、酵母粉（Yeast Extract）5g,用去离子水充分溶解定容至1L，115℃高压灭菌20min，放于80℃烘箱中30min后取出待用。
LB固体培养基：氯化钠（NaCl）10g、蛋白胨（Tryptone）10g、酵母粉（Yeast Extract）5g, 琼脂15g,用去离子水充分溶解定容至1L，115℃高压灭菌20min，放于80℃烘箱中10mi *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
n后取出，倒入一次性平板中，每块平板约15mL，待平板晾干后放于4℃冰箱中待用。
PBS Butter：氯化钠8.0 g、氯化钾0.2 g、十二水和磷酸氢二钠 3.5 g、磷酸二氢钾 0.27 g，去离子水充分溶解，调节pH至7.4，定容至1 L，高温高压灭菌后待用。
4%多聚甲醛：4g多聚甲醛加入到0.1M PBS中，定容至100 ml，加入适量1 mol/L NaOH促进溶解，调PH至7.4；
Bouin’s液：75mL苦味酸、25mL多聚甲醛、5mL冰醋酸加到一起混匀，分装待用。
1.1.3试验动物
8周龄体重相近的Balb/c雌性小鼠，购自扬州大学比较医学中心。
1.1.4试剂及耗材：
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